mHCN4基因修饰大鼠骨髓间充质干细胞体外诱导分化为心脏起搏样细胞的实验研究

摘要

研究背景与目的：病态窦房结综合征(简称病窦综合征)临床常见，对人体健康危害极大，且发病机理不清，也无有效防治措施。目前，病窦综合征的治疗以植入电子心脏起搏器为首选，但电子心脏起搏器价格昂贵、电池寿命有限、需要定期检测及更换，以及植入电子心脏起搏器可发生一些难以避免的并发症，使其应用受限。因此，探讨对病窦综合征患者窦房结结构与功能进行修复，重建一个具有正常生理功能的“生物心脏起搏器”，以取代电子心脏起搏器治疗，则是当今心脏电生理学界研究的热点之一。近年来，虽有少数将骨髓间充质干细胞(MSCs)直接或修饰后移植至生物体内以构建心脏起搏点的研究，但其结果尚不十分令人满意，其主要问题是移植细胞在体内存活时间短、心率增快不明显及心率变异性低等，表明现有的“种子细胞”尚不能满足构建“生物心脏起搏器”的需要。因此，探索寻找适合构建生物心脏起搏器的“种子细胞”，已成为当前心脏电生理学研究的重点内容之一。 既往研究表明，起搏电流(funny current，I<,f>)是心脏窦房结细胞自律性产生与维持的决定因素，而超极化激活的环化核苷酸门控通道(HCN)基因家族则是I<,f>形成的分子基础。HCN基因家族包括四个成员，即HCN1～HCN4，其中HCN4与I<,f>的形成关系最为密切。为探讨mHCN4基因修饰的大鼠MSCs作为构建生物心脏起搏器“种子细胞”的可行性，本研究在国家自然科学基金(30370585)的资助下，利用本课题组在前期研究中构建的mHCN4基因逆转录病毒载体，对大鼠MSCs进行转染，并在体外诱导培养，以期获得具有自律性的心脏起搏样细胞，为构建生物心脏起搏器提供“种子细胞”。 研究方法： 1．以mHCN4逆转录病毒载体(pMSCV-mHCN4-EGFP)及不含mHCN4的逆转录病毒对照载体(pMSCV-EGFP)分别转染大鼠MSCs，并进行嘌呤霉素加压筛选，观察绿荧光蛋白表达情况，并以免疫细胞化学检测mHCN4基因表达，以全细胞膜片钳技术对重组mHCN4通道进行动力学测定。 2．将获得的mHCN4基因修饰大鼠MSCs进行体外诱导培养，用倒置显微镜进行活细胞形态学的动态观察。 3．用透射电镜观察诱导培养后细胞的超微结构，用免疫细胞化学法检测细胞α-actin、cTnT及Cx43的表达，用膜片钳技术记录细胞的动作电位。 4．对转染mHCN4基因的大鼠MSCs与分离的普通心房肌细胞进行混合培养，用透射镜电观察细胞间结构连接情况；用荧光光漂白后恢复技术(FRAP)检测细胞间通讯功能状况。 研究结果： 1．成功将mHCN4逆转录病毒载体(pMSCV-mHCN4-EGFP)转染至大鼠MSCs，并经加压筛选获得了稳定表达mHCN4基因的大鼠MSCs。 2．对获得的稳定表达mHCN4基因的大鼠MSCs进行细胞膜片钳检测，可记录到超极化激活的内向电流，其半数最大激活电压为-98.2±5.7mV，反转电位是22.5±5.2mV，在-140mV指令电位时的激活时间常数为451±61ms。该电流具有明显的时间及电压依赖特性，且对细胞外Cs<'+>高度敏感。在相同记录条件下，仅转染pMSCV-EGFP的大鼠MSCs及未转染组大鼠MSCs均未记录到明确的超极化内向电流。 3．对mHCN4基因修饰的大鼠MSCs进行诱导培养，用倒置显微镜进行活细胞观察发现，普通培养10天左右，可观察到搏动细胞出现，细胞呈长杆状，搏动频率88-318次不等，平均202±72.9次/分，单个细胞自主搏动2-3天后停止，其收缩最明显地部位出现空泡状结构。随后搏动细胞不断出现，呈集落生长，可观察到短梭形、单细胞核细胞搏动。GFP组细胞仅见少量长杆状细胞出现，未观察到细胞自主搏动，对照组细胞形态未见明显变化及细胞的自主搏动。 4．选择普通培养14天的搏动细胞，用全细胞膜片钳技术检测发现，该细胞可记录到窦房结细胞样的动作电位(平均最大舒张电位为-50.9±4.8mV，平均动作电位幅度为62.9±5.2mV)； 5．搏动细胞经免疫细胞化学检测，该细胞不但表达mHCN4通道，同时表达心肌特异性蛋白α-actin及cTnT；透射电镜观察也发现其细胞内有明显肌丝分布，但肌丝的排列紊乱与稀少，未见肌节样结构形成，胞浆内可见丰富的颗粒、少量线粒体，其结构特点与乳鼠窦房结细胞超微结构非常相似。 6．经检测mHCN4基因修饰大鼠MSCs可表达Cx43，其表达水平明显较GFP组及未转染组高，与心房肌细胞的Cx43表达水平无明显差异。 7．透射电镜观察发现到mHCN4基因修饰大鼠MSCs可与相邻细胞间可形成指状交错的连接，并可观察到缝管连接的形成。 8．经荧光光漂白后恢复技术(FRAP)检测发现mHCN4阳性细胞组及mHCN4阳性细胞与心房肌细胞共培养组的平均荧光恢复率明显高于GFP阳性细胞组及GFP阳性细胞与心房肌细胞共培养组，并与心房肌细胞组相似。 本研究结论： 1．mHCN4可成功转染至大鼠MSCs，并可稳定持续的表达。 2．mHCN4基因修饰的大鼠MSCs可记录到If，表明其已具有心脏起搏细胞的电生理特性。 3．mHCN4基因修饰大鼠MSCs可在体外诱导分化为具有自律性的心脏起搏样细胞。 4．mHCN4基因修饰大鼠MSCs高度表达Cx43，并可与混合培养的心房肌细胞产生缝隙连接，并存在有效的胞间通讯。

目录

论文说明：英文缩写一览表

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摘要

前 言

第一部分mHCN4逆转录病毒载体转染大鼠MSCs及鉴定

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分mHCN4基因修饰大鼠MSCs体外诱导分化及鉴定

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分mHCN4基因修饰大鼠MSCs细胞间连接功能的检测

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致 谢

照 片

参考文献

文献综述一　心脏中超极化激活环化核苷酸门控通道的研究进展

文献综述二　心脏生物起搏器的实验研究进展

研究生期间发表或交流的论文