缺氧预适应小鼠脑匀浆液对离体细胞缺氧耐受性的影响及其可能有效组分的初步研究

摘要

本研究通过观察不同实验条件对急性重复缺氧预适应小鼠模型的影响，建立稳定可靠、效果显著的小鼠缺氧预适应模型。由于动物对缺氧的耐受性个体差异较大，影响因素较多，因此为便于控制实验条件和探索增强缺氧耐受性的物质特性，本研究采用离体细胞观察急性重复缺氧预适应小鼠脑匀浆液对离体细胞缺氧耐受性的影响。在确定急性重复缺氧预适应小鼠脑匀浆液增强不同离体培养细胞(PC12、HepG2以及NGF诱导分化的PC12细胞)缺氧耐受效果和有效浓度的基础上，以NGF诱导分化的PC12细胞作为观察对象，进一步将该提取液分成蛋白部分和非蛋白部分，探讨其中存在的增强细胞缺氧耐受性的可能组分。实验分三部分进行。 方法： 第一部分：急性重复缺氧预适应小鼠模型的复制 (1).使小鼠一次性缺氧致死，以观察小鼠缺氧致死前的变化规律。 (2).将小鼠连续4次重复缺氧，以观察小鼠每次缺氧耐受时间的变化。 (3).将小鼠分成2组，均经过连续4次缺氧，2组小鼠每次结束缺氧的标准分别是呼吸频率约40次/min或出现第1次喘呼吸，以观察每次不同时间缺氧对小鼠缺氧耐受性的影响。 (4).将小鼠分成2组，均经过连续4次缺氧，2组小鼠每次结束缺氧的标准分别是第一次喘呼吸或末次喘呼吸，以观察每次不同时间缺氧对小鼠缺氧耐受性的影响。 (5).将小鼠分成4组，均经过连续4次缺氧，但4组小鼠连续4次缺氧的环境温度分别是：9-11℃、13-15℃、17-19℃、21-23℃，以观察不同环境温度对小鼠缺氧耐受性的影响。 (6).将小鼠分成2组，均经连续4次缺氧，2次缺氧间的操作时间分别是5-15s或20-30s，以观察不同复氧时间对小鼠缺氧耐受性的影响。 (7).将连续4次缺氧的小鼠恢复常氧，30min后再放回缺氧瓶缺氧1次，以观察小鼠缺氧耐受性的变化。 第二部分：缺氧预适应小鼠脑匀浆液对未用NGF诱导分化的PC12细胞、HepG2细胞以及NGF诱导分化的PC12细胞缺氧耐受性的影响 1.以不同浓度的小鼠脑匀浆液分别作用于未用NGF诱导的PC12细胞，观察缺氧24h、48h、72h时PC12细胞的活力、LDH透出率、早期凋亡率、晚期凋亡率的变化规律。 2.以不同浓度的小鼠脑匀浆液分别作用于HepG2细胞，观察缺氧24h、48h、72h缺氧时HepG2细胞的活力、早期凋亡率、晚期凋亡率的变化规律。 3.仅以较低浓度范围小鼠脑匀浆液分别作用于NGF诱导分化的PC12细胞，观察缺氧24h、48h、72h时分化PC12细胞的活力、LDH透出率，晚期凋亡率的变化规律，以探索缺氧预适应小鼠脑匀浆液对缺氧、NGF诱导分化的PC12细胞起保护作用的最适浓度。 第三部分：缺氧预适应小鼠脑匀浆液不同组分对NGF诱导分化的PC12细胞缺氧耐受性的影响及其可能有效成分的初步探讨 (1).以高氯酸除蛋白法制备缺氧预适应小鼠脑匀浆去蛋白液，HPLc法测定其腺苷含量。用小鼠脑匀浆去蛋白液作用于NGF诱导分化PC12细胞，以确定去蛋白液对缺氧的分化PC12细胞有无保护作用；以小鼠脑匀浆去蛋白液合并腺苷A1或A2A受体阻断剂作用于分化PC12细胞，以确定小鼠脑匀浆去蛋白液的作用是否与腺苷有关。 (2).透析法除去缺氧预适应小鼠脑匀浆液中小分子物质，并观察透析保留液对缺氧的分化PC12细胞有无保护作用；分别用RT-PCR、Westernblot方法检测缺氧预适应小鼠脑组织中VEGFmRNA、VEGF的蛋白水平是否增加。用重组VEGF纯品作用于分化PC12细胞，以确定透析保留液对分化PC12细胞的保护作用是否与VEGF有关。 结果与讨论： (一)影响急性重复缺氧模型因素 1.小鼠经4次急性重复缺氧后，每次缺氧耐受时间显著增加。这一结果提示，小鼠在每次缺氧后，均在体内产生了增强缺氧耐受性的物质，并且各次缺氧后缺氧耐受的物质有积累效应。 2.在小鼠出现第一次喘呼吸时将小鼠换入下一个缺氧瓶与小鼠呼吸频率在40次/min时换瓶比较，可显著提高小鼠每次耐受时间。这是因为小鼠在呼吸频率为40次/min时，缺氧程度尚未达到缺氧耐受形成的程度，因此对缺氧的耐受性也不强，因为缺氧预适应的形成需要足够程度的缺氧。 3.在小鼠出现第一次喘呼吸时将小鼠换入下一个缺氧瓶与小鼠出现末次喘呼吸时换瓶比较，缺氧耐受时间无显著差异。其原因是，不同小鼠喘呼吸次数不同，有的小鼠喘呼吸3-5次即死亡，有的小鼠喘呼吸却可达30次以上，因此小鼠的个体差异较大，使组间无显著差异，并且末次喘呼吸难以判断，以其作为结束缺氧标准导致小鼠死亡率增加。 4.随着环境温度的增加，小鼠的缺氧耐受时间显著降低。这可能是因为低温可减少小鼠体内有害物质的产生、降低代谢，有利于缺氧预适应的形成。 5.每次对小鼠换瓶操作时间长于15s会显著降低小鼠的缺氧耐受时间。其原因可能是复氧时间太长，因为复氧时间短暂有利于预适应的形成。由于小鼠4次缺氧耐受性的完全消失需要至少30分钟以上的时间，因此赋予预适应小鼠缺氧耐受性的物质，可能部分对机体恢复常氧供应较为敏感，但部分能维持较长时间。 (二)缺氧预适应小鼠脑匀浆液对未用NGF诱导的PC12细胞、HepG2细胞、NGF诱导分化PC12细胞缺氧耐受性的影响 1.缺氧预适应小鼠脑匀浆液对缺氧、未用NGF诱导的PC12细胞、HepG2细胞缺氧耐受性的影响是：缺氧预适应小鼠脑匀浆液可显著提高细胞对缺氧的耐受性。在缺氧初期(24h)，较高浓度的保护作用显著强于低浓度的保护作用，这提示缺氧预适应小鼠脑组织中产生了某种或某些可以增强细胞缺氧耐受性的物质或使脑组织中抗缺氧成分表达增加。随着缺氧时间延长，保护作用下降，高浓度的下降更快。至缺氧72h，高浓度提取液的缺氧损伤作用显著高于低浓度组，该结果提示，缺氧预适应小鼠脑组织中可能产生了半衰期较短的抗缺氧物质及在高浓度时才显示作用的、作用时间持久的促缺氧细胞损伤的物质，即提示缺氧预适应有着双相效应，缺氧预适应小鼠脑匀浆的作用存在量效关系和时间效应。为此，在后续缺氧预适应小鼠脑匀浆液对分化PC12细胞的作用研究中，以蛋白浓度对提取液进行定量，并降低实验中所用提取液的浓度范围。 2.蛋白终浓度为100.0μg/mL的缺氧预适应小鼠脑匀浆液与同浓度正常小鼠脑匀浆液比较，可显著增强NGF诱导分化PC12细胞的缺氧耐受性，并且此浓度的缺氧预适应小鼠脑匀浆液对分化PC12细胞未显示出损伤作用，为增强分化PC12细胞缺氧耐受性的适合浓度。 (三)缺氧预适应小鼠脑匀浆液不同组分对NGF诱导分化的PC12细胞缺氧耐受性的影响及其可能有效成分的初步探讨 1.向离体培养细胞中加入不同浓度的腺苷，随着腺苷浓度增加，细胞的缺氧耐受性增高，10.0μmol/L的腺苷的细胞保护作用可维持24h。急性4次重复缺氧可使小鼠脑组织腺苷含量由正常时的4.49μmol/L，上升至10.62μmol/L。缺氧预适应小鼠脑匀浆去蛋白液只在缺氧的24h内显著增加分化PC12细胞的缺氧耐受性，腺苷A2A受体阻断剂可阻断其保护作用。正常小鼠脑匀浆去蛋白液对分化PC12细胞无保护作用。因此，缺氧预适应小鼠脑匀浆液的非蛋白组分的抗缺氧作用时间较短，腺苷可能是其中一个重要的活性物质。 2.在缺氧24h和48h，缺氧预适应小鼠脑匀浆透析保留液与未经透析的缺氧预适应小鼠脑匀浆液对分化PC12细胞均有保护作用，且经两种孔径(3.5kD、7.0kD)透析袋透析的缺氧预适应小鼠脑匀浆透析保留液和未经透析的缺氧预适应小鼠脑匀浆液对缺氧细胞的保护作用无显著差异，说明缺氧预适应小鼠脑组织中起保护作用的主要是分子量大于7.0kD的蛋白成分。急性重复缺氧预适应小鼠脑组织中VEGF表达虽增加，但应用重组VEGF直接作用于分化的PC12细胞发现，不同浓度的VEGF对NGF诱导分化的、不同缺氧时间的PC12细胞均无保护作用。这一结果提示：缺氧预适应小鼠脑匀浆液的蛋白组分抗缺氧作用较为持久，其中VEGF表达量虽增高，但并不参与NGF诱导分化的PC12细胞的抗缺氧作用。由于缺氧预适应小鼠脑匀浆液的蛋白组分抗缺氧作用时间持久，提示蛋白质组学方法将是研究其中抗缺氧成分的有效方法，为今后的进一步研究提示了方向。 结论： 1.赋予重复缺氧小鼠缺氧耐受性的物质，部分对机体恢复常氧供应较为敏感，部分则能持续较长时间； 2.缺氧预适应小鼠脑匀浆液对离体缺氧培养细胞的作用表现为双相性--缺氧早期，脑匀浆液对缺氧细胞具有保护效应，延长缺氧时间，其损伤作用逐渐显现，这种双相作用存在量效关系和时间效应； 3.缺氧预适应小鼠脑匀浆液可显著提高不同来源离体培养细胞的缺氧耐受性，提示对缺氧细胞具有普遍的保护作用； 4.缺氧预适应小鼠脑匀浆液的蛋白组分抗缺氧作用较为持久，其中VEGF表达量虽增高，但并不参与NGF诱导分化的PC12细胞的抗缺氧作用； 5.缺氧预适应小鼠脑匀浆液的非蛋白组分的抗缺氧作用时间较短，腺苷可能是其中一个重要的活性物质。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分急性重复低氧小鼠模型的复制

材料和方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第二部分 缺氧预适应小鼠脑匀浆液对PC12、HepG2以及NGF诱导分化的PC12细胞缺氧耐受性的影响

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

第三部分 缺氧预适应小鼠脑匀浆不同组分对NGF诱导分化的PC12细胞缺氧耐受性的影响及其可能有效成分的初步探讨

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

参考文献

全文结论

致 谢

文献综述之一低氧对神经干细胞、造血干细胞增殖调控的影响

文献综述二 VEGF在缺氧预适应中的脑保护作用

在读博士期间撰写文章

英文论著