改良制备异种脱蛋白骨构建组织工程骨修复胫骨大段骨缺损的实验研究

摘要

研究背景：由于创伤、骨病或肿瘤引起的大段骨缺损是骨科临床上经常遇到的棘手问题之一，目前常用的方法是植骨术。移植物来源包括自体骨、同种异体骨、异种骨及各种无活性的人工骨等。自体骨移植存在来源有限、取骨处有并发症、二次手术等缺陷；同种异体骨有伦理、传播传染性疾病、免疫排斥及来源亦有限等；异种骨除了伦理、传播疾病之外，作为移植材料最大的障碍是免疫排斥；各种无活力的人工骨只是单纯的人工替代材料，存在降解困难或降解速率与骨生长速率不一致，影响成骨或机体功能。组织工程学的兴起为大段骨缺损的修复带来了新的希望。利用体外细胞培养技术将种子细胞扩增并和可降解的生物材料复合培养构建有生命活力的组织，植入体内修复缺损，重建骨的功能已不再是遥远的梦想。目前自体细胞来源的组织工程骨研究动物实验已取得了骄人的成绩，并已初步试用于临床，取得了一定的成功。然而，支架材料仍是制约组织工程骨大规模临床应用的瓶颈，制备来源丰富、价格低廉、性能优良的支架材料是研究热点之一。近年来国内外虽然有异种骨用于骨组织工程支架材料的许多研究，如Keil骨、Bio-Oss骨等，但没有完全解决异种骨的免疫原性及生物力学性能等问题。基于此，本实验以猪股骨为原料制备异种脱蛋白骨，在制备工艺上作了改进，主要是尽量保留胶原蛋白，去除非胶原蛋白、肽类、脂类及细胞等，在降低抗原性的同时保留力学强度，作了理化性能、生物安全性、细胞相容性及小型动物成骨等检测。并以制备的异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料与山羊自体骨髓间充质干细胞复合，加入成骨性骨诱导因子rhBMP2构建组织工程骨修复山羊胫骨中下段20％节段性缺损，观察成骨能力和免疫排斥反情况，为异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料进入临床提供实验依据。 目的： 评估改良法制备异种脱蛋白骨(Xenogenic Deprotein Bone，xDPB)作为组织工程支架材料修复大动物长骨大段骨缺损的能力，并对XDPB的免疫原性，新生骨的数量、质量进行评价，为异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料进入临床应用提供实验依据。 方法： (一)异种(猪)脱蛋白组织工程骨支架材料的改良制备和性能研究：参照改良法制备，将制备的脱蛋白骨放入-80℃超低温冰箱冷冻3月后取出，真空包装，Co<'60>照射后置-20℃保存。计算每块脱蛋白骨的平均质量、大小，扫描电镜观察并测定材料的孔径和孔隙率，氨基酸分析仪检测氨基酸种类和含量，万能生物力学测试仪检测材料的抗压缩、三点抗弯曲等力学指标。部分脱蛋白骨块于术前浸入含rhBMP<,2>浓度为75ng/ml溶液中2h备用。 (二)山羊MSCs培养、鉴定及生物学特性检测。1．MSCs培养：在山羊髂骨处用骨穿针穿刺抽取约10ml骨髓，分离MSCs，培养、收集细胞。 2．MSCs生物学特性观察：活细胞动态观察、倍增时间；3．MSCs定向诱导分化：第二代细胞进行成骨、成脂诱导培养及钙染色、脂肪染色、ALP染色、ALP活性测定和Ⅰ型胶原、骨钙素免疫组化染色等。 (三)异种脱蛋白骨支架材料的细胞相容性研究。1．异种脱蛋白骨支架材料与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养：倒置镜、扫描电镜观察细胞在材料表面、孔隙内附着、生长和增殖情况。2．异种脱蛋白骨构建组织工程骨植入大动物体内的免疫学研究：山羊24只，分两组，自体骨对照组6只(自体骨)和实验组18只(异种脱蛋白骨)，分别于术后0、3、7、14、28、56天抽外周血，流式细胞仪检测细胞免疫和ILISA检测体液免疫指标。3．在体支架材料内Brd

目录

论文说明：英文缩写词表

声明

摘要

前 言

第一部分 异种(猪)脱蛋白组织工程骨支架材料的改良制备和性能研究

前言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第一部分照片

参考文献

第二部分 山羊MSCs培养、鉴定及生物学特性检测

前言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分照片

参考文献

第三部分 异种脱蛋白骨支架材料的相容性研究

前言

实验一 异种脱蛋白骨支架材料与山羊骨髓间充质干细胞的复合培养

材料与方法

结 果

讨论

小 结

实验二 异种脱蛋白骨构建组织工程骨植入大动物体内的免疫学研究

前言

材料与方法

结 果

讨论

小 结

实验三在体支架材料内BrdU标记自体MSCs增殖的大动物示踪研究

前言

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第三部分照片

参考文献

第四部分异种脱蛋白骨(猪)构建组织工程骨修复山羊胫骨大段骨缺损的实验研究

前言

材料与方法

结 果

讨论

小结

第四部分照片

参考文献

全文总结

致 谢

文献综述异种骨移植修复骨缺损的研究进展

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