BC047440的原核表达、多克隆抗体制备及其在蛋白质水平表达的初步研究

摘要

原发性肝癌是一种常见的恶性肿瘤，发病率有逐年上升的趋势。虽然目前对其发病机制的了解较前有了明显进步，但还存在许多需要研究的地方。我们在前期的研究中已发现了1条在肝癌中高表达但其功能未知的基因(登录号BC047440)，并发现其在肝癌组织中的表达高于癌旁组织，且该基因的功能与肝癌生长增殖有关。为了进一步研究：BC047440在肝癌发生、发展中的作用，我们拟克隆、原核表达并制备BC047440多克隆抗体，并通过免疫组化及Westernblot等方法检测肝癌中的蛋白表达，并分析其与肝癌临床病理特征、术后生存期的关系，以进一步探讨BC047440基因在肝细胞癌发生、发展和侵袭转移中的作用。 目的：构建BC047440原核表达载体，诱导表达BC047440融合蛋白，并经亲和层析法纯化，将其作为抗原免疫兔，制备兔抗人BC047440多克隆抗体，纯化抗体后，在蛋白水平检测该基因在肝癌中的表达情况并进行临床病理学分析，为进一步揭示BC047440基因在肝癌发生、发展中的作用，对揭示肝癌发生的分子机制奠定理论基础。 方法： 1、复苏、培养人HepG2细胞，提取其总RNA，通过RT-PCR获得人BC047440编码区基因片断，构建含目的基因的T载体克隆及原核细胞表达载体亚克隆，并经酶切、测序证实。IPTG诱导表达。BC047440融合蛋白，Westernblot证实其抗原性。将重组基因工程菌扩大诱导表达，亲和层析法纯化诱导的蛋白。 2、将纯化的蛋白与弗氏佐剂乳化，将其作为抗原免疫兔，获得兔抗人血清，经饱和硫酸铵纯化，获得初步纯化的兔抗人BC047440多克隆抗体，通过间接ELISA检测多克隆抗体效价，用双向琼脂免疫扩散试验检测其纯度，westernblot及免疫组化方法初步检测其活性。 3、收集手术切除肝癌标本，应用免疫组化及westernblot方法检测了BC047440在肝癌、癌旁肝组织及正常肝组织中的BC047440蛋白表达，并分析其与肝癌临床病理特征、术后生存率等的关系，以探讨BC047440基因在肝细胞癌发生、发展和侵袭转移中的作用。 结果： 1、获得人BC047440编码区基因片段，并经测序证实。 2、获得人BC047440基因重组基因工程菌的克隆，并表达具有抗原性的BC047440融合蛋白。 3、获得纯化的BC047440融合蛋白，并用其免疫兔，得到兔抗人BC047440多克隆抗体。 4、以重组蛋白为抗原，用间接ELISA检测BC047440抗血清的效价达到1:256000。 5、双向琼脂免疫扩散试验显示BC047440多克隆抗体与免疫原之间形成单一沉淀线，表明所制备的多抗具有良好的纯度。 6、免疫印迹分析BC047440抗血清在分子量约23kd处与相应的原核表达蛋白呈现特异性结合条带，表明所制备的多克隆抗体具有较好的免疫学活性。 7、免疫组化染色显示BC047440表达部位主要位于胞浆，在肝癌及癌旁组织均有表达，但肝癌组织中的表达明显强于癌旁肝组织及正常肝组织。 8、58例肝癌标本的免疫组化检测中，BC047440表达阳性数为47(81.0％)。58例癌旁肝组织标本中，BC047440表达阳性数为12(20.7％)。作为阴性对照的正常肝组织中，BC047440表达阳性数为0。 9、BC0474410免疫组化检测为阳性的肝癌患者(47例)和阴性的肝癌患者(11例)在病理学分级、门静脉侵犯、肿瘤包膜侵犯上的差异有显著意义(P＜0.05)。而在AFP定性、肿瘤大小、HbsAg定性上的差异无显著意义(P＞0.05)。 10、肝癌BC047440免疫组化检测为阳性的患者3年生存率明显比BC047440阴性的患者低(p＜0.05)，BC047440表达阳性和门静脉侵犯共同存在时患者的3年生存率比在两者都阴性的患者明显降低(p＜0.05)，BC047440表达阳性和肿瘤包膜侵犯共同存在时患者的3年生存率比在两者都阴性的患者明显降低(p＜0.05)。 11、Westernblot检测BC047440在肝癌组织和癌旁肝组织中表达量的差异有显著意义(P＜0.05)，在肝癌组织和正常肝组织中表达量的差异有显著意义(P＜0.05)，而在癌旁肝组织和正常肝组织中表达的差异量无显著意义(P＞0.05)。 12、Westernblot检测BC047440高表达的患者(32例)和低表达的患者(26例)在侵袭、转移相关临床病理学特征(病理学分级、肿瘤包膜侵犯、门静脉侵犯)上的差异均具有显著意义(P＜0.05)。 结论：经重组基因工程菌诱导表达的BC047440融合蛋白具有免疫原性，将其作为免疫原制备的兔抗人BC047440多克隆抗体能与BC047440融合蛋白发生反应，检测BC047440多克隆抗体效价、纯度、活性均达到预期要求。检测BC047440在蛋白质水平表达发现，BC047440在肝癌中的表达例数(量)明显高于癌旁肝组织和正常肝组织，BC047440的高表达与肝细胞癌的侵袭性、转移性的增强，患者预后差有着密切的关系。BC047440可能在肝细胞癌初期的发生发展以及后期的侵袭转移中均起到了重要的调节作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

声明

前 言

第一部分BC047440基因的克隆及原核表达

引 言

材料与方法

结 果

讨 论

参考文献

第二部分BC047440多克隆抗体的制备

引 言

材料与方法

结 果

讨论

参考文献

第三部分 肝癌组织中BC047440蛋白的表达及其意义

引 言

材料和方法

结 果

讨 论

参考文献

全文结论

致 谢

文献综述一肝癌的分子靶向治疗研究进展

文献综述二肿瘤的基因治疗研究进展

在读博士期间发表论文