缺氧和血管紧张素Ⅱ对血管内皮细胞的损伤与银杏叶提取物的保护作用研究

摘要

血管内皮细胞(vascular endothelial cell，VEC)是血管屏障的重要组成部分，可以合成和分泌多种生物活性物质，在调节血管收缩舒张功能、维持内环境稳定等方面具有重要意义。VEC功能障碍是多种心血管疾病的发病基础，也和呼吸、生殖、神经内分泌、肿瘤及风湿性疾病等密切相关。VEC功能障碍的评价方法主要包括循环内皮细胞检测、内皮细胞分泌活性物质的测定、内皮细胞内钙离子浓度和线粒体膜电位的测定、冠状动脉内皮功能的检测等方法，综合运用上述评价方法，有利于探讨VEC功能障碍的发生机制。研究发现，在上述多种疾病的发生中，VEC既是受损的“靶”细胞，又是损伤的“激发”细胞，因此，从整体、细胞和分子水平进行VEC损伤及保护性研究是防治多种疾病的重点课题之一。 缺氧是导致VEC损伤的极为常见的病理因素，血管紧张素II(angiotensin II，Ang II)是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)直接作用于血管床使血管收缩的重要的血管活性肽，Ang II是该系统中最为重要的血管活性物质，它行使着循环内分泌系统和组织旁分泌/自分泌系统的功能，Ang II可引起血管内皮功能低下。缺氧和Angll在高血压、动脉硬化、心衰和肺动脉高压等疾病的发生发展过程中起重要作用。在现代航天航空活动中，因缺氧引起的航空事故及事故征候仍占有相当比例，因此，以加强内源性抗损伤的医疗思想为指导，将利用现代技术提取的副作用较少的植物提取物应用于缺氧损伤与保护作用的研究具有重要意义。 目的：通过建立VEC缺氧损伤模型，应用激光共聚焦显微镜观察缺氧条件下Ang II引起VEC钙离子浓度及线粒体膜电位(mitochondria membrane potential，MMP)的变化，应用放射免疫法测定在缺氧和Ang II作用后VEC培养液中内皮素( endothelin，ET)含量的变化，并观察银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)对上述变化的影响，探讨GBE对VEC的保护作用机制。 方法： 一、选用人大动脉血管内皮细胞，常规复苏传代，建立VEC缺氧损伤模型。 二、实验设为空白对照组、缺氧组、缺氧+GBE保护组、Ang II作用组、Ang II+GBE保护组、缺氧+Ang II作用组及缺氧+Ang II+GBE保护组等七组。各组细胞分别在不同因素作用后，应用Fluo-3/AM负载，用激光共聚焦显微镜测定VEC内Fluo-3的荧光强度值以代表VEC内的Ca2+浓度；各组细胞分别在不同因素作用后，应用Rhodamine123(Rh123)负载，用激光共聚焦显微镜测定VEC内Rh123的荧光强度值以代表VEC内的MMP。 三、将培养的VEC按每12孔一组分为上述七组，各组细胞分别在不同因素作用后，吸取VEC培养上清液，应用放射免疫技术，测定VEC培养上清液中的ET含量。 结果： 一、与对照组比较，经过缺氧作用后，VEC内Ca2+浓度明显升高(P<0.01)，MMP明显降低(P<0.01)，VEC培养上清液中的ET含量明显增加(P<0.001)。 二、与对照组比较，经过Ang II作用后，VEC内Ca2+浓度明显升高(P<0.01)，MMP明显降低(P<0.01)，VEC培养上清液中的ET含量明显增加(P<0.001)。 三、与对照组比较，缺氧与Ang II联合作用后，VEC内Ca2+浓度明显升高(P<0.01)，MMP明显降低(P<0.01)，VEC培养上清液中的ET含量明显增加(P<0.001)，且比单纯缺氧作用及单纯Ang II作用的影响显著(P<0.05)。 四、与相应的损伤组比较，GBE保护组细胞内Ca2+浓度明显降低(P<0.01)，MMP明显升高(P<0.05)，VEC培养上清液中的ET含量明显下降(P<0.001)。 五、与对照组比较，各GBE保护组细胞内Ca2+浓度、MMP以及VEC培养上清液中的ET含量均未恢复至对照组水平，差异有显著意义(P<0.05)。 讨论： 一、缺氧对VEC内Ca2+浓度、MMP和培养上清液中ET含量的影响：Ca2+作为细胞内信使，参与各种调控细胞功能的信息转导过程，Ca2+超载是许多原因引起细胞损害的“最后共同通路”。细胞内Ca2+浓度由ATP酶依赖性钙泵、Na+/ Ca2+交换以及正常Ca2+通道调控。缺氧导致细胞氧化磷酸化功能抑制，细胞内ATP含量快速下降，钠钾泵功能障碍，导致细胞膜去极化而引起电压依赖型Ca2+通道开放，Ca2+内流；同时，缺氧使氧自由基清除系统功能降低或丧失，而生成系统却活性增强，氧自由基大量产生与急剧“堆积”，作用于内质网、线粒体等钙库，促进Ca2+超载.细胞内Ca2+超载触发线粒体膜通透性转换孔(Mitochondrial permeability transition pore，MPT)的开放，导致MMP下降；缺氧促进机体活性氧生成，活性氧生成过多可直接或间接损伤线粒体膜，造成MMP下降。VEC内氧自由基含量的增加以及脂质过氧化作用增强，导致VEC分泌ET的功能增强。本实验结果再次验证了缺氧可导致VEC内Ca2+浓度升高、MMP下降及VEC分泌ET增多。 二、Ang II对VEC内Ca2+浓度、MMP和培养上清液中ET含量的影响：生理情况下，低浓度的Ang II能维持血管的构造和张力；在病理情况下Ang II的浓度升高，可导致内皮细胞损伤。本研究观察到Ang II可引起VEC内Ca2+浓度升高、MMP下降和培养上清液中ET含量升高，造成了VEC的损伤。其机制可能为Ang II作用于VEC的血管紧张素II1型受体(AT1)，使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇生成三磷酸肌醇(IP3)增多，IP3可以诱导内质网Ca2+的释放；Ang II能够抑制VEC钙激活钾通道的作用，使VEC膜上的Na+-K+ATP酶活性降低，Na+- K+泵功能障碍，导致细胞膜去极化而引起电压依赖型Ca2+通道开放，Ca2+内流；Ang II导致的VEC内钙超载以及氧化应激，均可造成MMP的下降；Ang II刺激VEC内皮素前体的转录进而促进ET的分泌。 三、缺氧联合Ang II对VEC内Ca2+浓度、MMP和培养上清液中ET含量的影响：既往的研究大都是将缺氧与Ang II分别单独作用于血管内皮细胞后，观察血管内皮细胞内Ca2+浓度、MMP及培养上清中ET含量的变化，以评价血管内皮细胞的功能，本研究将缺氧与Ang II联合作用于VEC，发现二者联合作用与单纯缺氧或Ang II作用比较，VEC内Ca2+浓度升高、MMP下降和培养上清液中ET含量增加均更加显著，提示缺氧与Ang II对VEC的损伤有协同作用。其原因可能为缺氧比Ang II导致的VEC氧化应激损伤更强烈，而Ang II除具有导致氧化应激损伤外，还能作用于AT1受体，进一步通过IP3途径造成VEC的损伤。可以说Ang II加强了缺氧对VEC的损伤作用，从而使VEC的损伤较单纯缺氧作用及单纯Ang II作用加重。 四、银杏叶提取物对VEC内Ca2+浓度、MMP和培养上清液中ET含量的影响：细胞内Ca2+集聚是细胞不可逆性损伤过程中的重要环节，而VEC损伤后发生的功能改变则是导致相关疾病发生发展的重要因素，因此，避免或减轻VEC氧化应激损伤以及防止和减轻细胞内Ca2+集聚是防治细胞不可逆损伤的重要环节。GBE既能清除自由基、提高抗氧化酶活性，保证线粒体膜的稳定性，又能对抗Ang II抑制VEC的钙激活钾通道作用，最终可能激活VEC膜上的Na+-K+酶的活性，降低Ca2+通道的活性，阻止Ca2+内流及肌浆网Ca2+的释放，从而显示出钙通道阻滞剂的作用而有效抑制细胞内钙离子超载，避免MPT的开放，稳定MMP，也最终阻断ET mRNA的过多表达，达到降低ET水平的结果，表现出细胞保护作用。本研究结果表明GBE确实能减轻损伤所致的细胞内Ca2+浓度升高、MMP下降及ET分泌量增加的程度，提示其对缺氧和Ang II引起VEC损伤具有保护作用。但这种保护作用是不完全的，原因可能为GBE发挥的生物活性作用主要是抗氧化作用，不是完全的Ca2+通道阻滞剂，仅能部分阻滞胞外Ca2+内流；对激活Ca2+泵的作用有限；不能完全抑制内储钙的释放；其药理作用的发挥可能存在时-效和量-效关系，因此，GBE对VEC的保护作用是有限的。提示联合应用VEC保护药物及选择合适的药物浓度是今后研究的重点。 结论： 1.缺氧及Ang II可损伤VEC，导致Ca2+浓度升高、MMP下降和ET分泌量增加。 2.缺氧与Ang II联合作用可使VEC内Ca2+浓度升高、MMP下降和ET分泌量增加均更加显著，表明二者对VEC的损伤具有协同作用，提示在机体缺氧损伤过程中产生的Angll可加强缺氧对VEC的损害。 3.GBE对缺氧和Ang II引起的VEC损伤具有保护作用。

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声明

前 言

实验一缺氧和AngⅡ对血管内皮细胞Ca2+浓度的影响及银杏叶提取物的保护作用研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

实验二缺氧和AngⅡ对血管内皮细胞线粒体膜电位的影响及银杏叶提取物的保护作用研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

实验三缺氧和Ang Ⅱ对血管内皮细胞内皮素分泌功能的影响及银杏叶提取物的保护作用研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文总结

致 谢

参考文献

文献综述 血管内皮细胞功能障碍与保护策略

攻读硕士学位期间发表的论文