RCS大鼠变性过程中视网膜双极细胞形态学和电生理学特性研究

摘要

视网膜退行性变疾病是严重的致盲眼病，对于这类疾病目前尚缺乏有效阻止病变进展和恢复视网膜功能的治疗方法。其中，视网膜色素变性(Retinitis pigmentosa，RP)是一组以进行性感光细胞及色素上皮功能丧失为共同表现的遗传性疾病，是遗传性视觉损害和盲目的最常见原因之一。近年来对视网膜色素变性疾病的临床及基础研究取得一定进展，但视网膜色素变性的发病机制，及在病变过程中各种视网膜神经细胞的病理改变及功能状态尚不清楚。
　　 视网膜双极细胞是脊椎动物视网膜的谷氨酸中间神经元，接受光感受器细胞的信号输入，在整合后传递至无长突细胞和神经节细胞，双极细胞在视网膜信号传递的过程处于一个关键的位置。在正常哺乳类动物视网膜中视杆通路和视锥通路在外丛状层相互独立。视杆双极细胞均为ON型，视锥双极细胞分为ON型和OFF型，离子型谷氨酸能受体表达于OFF型双极细胞胞膜上，ON型双极细胞上以代谢性谷氨酸能受体为主，这两种受体分别为不同亚型双极细胞的主要功能性受体，对双极细胞的功能起着重要的作用。
　　 在多种视网膜变性动物模型的研究中，业已发现在视网膜变性过程中，视网膜双极细胞出现变构的现象。这种变构包括：1、双极细胞在变性过程中失去树突，其树突上谷氨酸受体的表达出现了变化。2、双极细胞能够伸出新的突起与残存的感光细胞形成异常连接。在针对以视锥细胞变性为主的视网膜变性动物模型的研究中发现，失去视锥感光细胞的视锥-双极细胞能够伸出突起与残存的视杆感光细胞产生新的连接，在以视杆细胞变性为主的动物模型中也有同样的发现，这些发现表明失去上一级信号传入的双极细胞在试图寻找新的信号输入。3、双极细胞因为膜表面蛋白分子的变化而表现出功能特性的一些变化，例如Varela发现失去视杆信号传入的视杆-双极细胞呈现出对GABA更为强烈的反应；另有文献表明，失去视杆细胞信号后的双极细胞mGluR6的mRNA表达水平在变性晚期呈现明显上升的趋势，这种现象可以理解为是对谷氨酸能受体丢失的一种反应，同时Marc发现在变性过程中，视网膜表达代谢性谷氨酸能受体的双极细胞减少，表达离子型谷氨酸能受体的双极细胞增加，说明变性过程中双极细胞的主要功能型受体的表达也发生了变化。而双极细胞的这一切变构特点会影响到双极细胞膜学电生理特性。
　　 在以视杆细胞变性为起始的视网膜变性动物模型中，首先受到影响的就是失去视杆信号来源的视杆双极细胞，在哺乳动物中视杆双极细胞均为ON型细胞，其类型相对于分型复杂的OFF型双极细胞较为单一。根据既往的研究，我们推测残存的视杆双极细胞在失去视杆细胞的信号输入后，会向其他残存的感光细胞例如视锥细胞伸出异常突起，并从而导致自身形态学和膜学特性上的进一步变化。我们现有的技术手段还不能精确和完整的显示这种异常突起连接的形态和功能，并观察其对双极细胞的影响。但是通过双极细胞形态和电学特性的研究，我们可以从侧面尝试了解这种异常连接带来的变化，从而更多的了解网膜变性中ON型双极细胞变构的特性。
　　 那么，在以视杆细胞变性为起始视网膜色素变性疾病发展过程中，ON型双极细胞形态及膜学电生理特性究竟发生了怎样的改变，这一切其至今未见研究报道，值得我们深入的研究。
　　 综上所诉，我们假设在以视杆细胞变性为起始的RCS大鼠动物模型中，随着感光细胞的不断变性死亡，ON型双极细胞因失去正常感光细胞的信号输入后发生了变构，可能出现了和视锥细胞之间的异常连接，导致ON型双极细胞出现了形态学以及电生理学特性的改变。
　　 针对上述假说，本文的研究内容和主要研究结果如下：
　　 1、不同发育阶段RCS鼠视网膜ON-RBCs形态学特征的研究。采用冰冻切片、免疫荧光化学方法特异性标记RCS鼠视网膜ON-RBCs细胞，研究在视网膜变性发展过程中，ON-RBCs细胞的病理改变，并对大鼠的ON-RBCs进行单细胞内Lucifer Yellow染色以观察单个双极细胞形态的改变。结果发现：1)RCS鼠视网膜色素变性过程中，ON-RBCs在总体数量上呈现下降趋势，在P60d起显著低于对照组大鼠。表明失去上一级信号传入后，ON-RBCs不可避免的发生继发性死亡，这属于视网膜神经层神经元在变性过程中的变构特征之一。2)RCS大鼠视网膜色素变性过程中，在视锥感光细胞集中的后极部网膜区域，在变性后期呈现出mGluR6阳性双极细胞数量增加的趋势。原因可能系有新的异常信号的传入促进了ON-RBC的存活，并促使其他区域的ON-RBCs的异位迁徙。3)RCS大鼠视网膜色素变性过程中，以视杆感光细胞为主的中周部网膜区域，ON-RBCs因为失去信号传入，数量急剧下降，P60d起显著低于对照组大鼠。证明了失去信号来源的双极细胞继发于感光细胞出现大量的变性死亡，间接证明了得到视锥信号支持的ON-RBCs能够更好的存活。4)RCS大鼠视网膜色素变性过程中，树突形态发育不良，轴突终末分支减少，细胞呈现幼稚状态，同时双极细胞在视网膜变性过程中向不同方向伸出mGluR6表达阳性的异常突起。在变性晚期，这些异常突起纠缠成结，并可见功能性突触存在的证据。说明网膜变性过程中的双极细胞为寻找新的信号传入具有一定的突触可塑性，这种可塑性现象为进一步解释视网膜变性特点以及开展视网膜拯救措施提供了新的依据。
　　 2、RCS鼠视网膜变性过程中ON-RBCs细胞电生理学特性研究。采用在视网膜切片上对ON-RBCs细胞膜片钳记录的方法，对不同发育阶段的RCS鼠ON-RBCs细胞进行全细胞记录，研究ON-RBCs细胞在视网膜变性发展过程中基本膜学特性、外向K+电流的性质及大小的变化。结果发现：1)RCS鼠视网膜变性过程中ON-RBCs细胞的静息膜电位逐渐降低，输入阻逐渐升高，均与对照组有显著差异，说明RCS鼠视网膜ON-RBCs细胞膜逐渐去极化。RCS鼠视网膜变性过程中ON-RBCs细胞的膜电容逐渐增加，且显著高于对照组，说明RCS鼠视网膜ON-RBCs细胞膜在面积和体积上发生了变化，2)在给予去极化脉冲时，ON-RBCs细胞主要表现出外向的K+电流，能够被TEA及阻断。说明正常ON-RBCs细胞膜上离子通道以K+通道为主，以外向性钾离子电流为主的特性。3)在视网膜变性过程中，ON-RBCs细胞外向K+电流增大，表现出异于对照组ON-RBCs的外向型钾离子电流特性，说明在变性过程中ON-RBCs功能活动特性发生了变化。4)RCS鼠P60d和P90d时K+电流密度显著高于对照组(P<0.05)。提示随视网膜色素变性进展，ON-RBCs细胞膜上单位面积K+电流增加，说明RCS鼠ON-RBCs细胞膜上K+通道类型和数量以及功能活性发生改变。5)RCS鼠ON-RBCs细胞K+通道Ⅰ-Ⅴ曲线的变化同样符合其离子电流变化特性，即在视网膜变性过程中ON-RBCs细胞胞膜上K+离子通道活性的改变，因而相对于对照组，随着膜电位的去极化，细胞膜K+电流升高更加明显。6)RCS大鼠在P60和P90d时，其ON-RBCs在去极化时表现出的外向型钾离子电流幅值以及电流密度介于对照组ON-RBCs和OFF-RBCs之间，膜学特性与两者均有显著差异。
　　 因此，我们得出以下结论：
　　 1)RCS大鼠视网膜变性过程中，ON-RBCs在总体数量上呈现下降趋势。表明失去上一级信号传入后，ON-RBCs不可避免的发生继发性的数量上的丢失；2)RCS大鼠视网膜变性过程中，周边视杆细胞集中的中周部网膜区域，ON-RBCs因为失去信号传入，数量急剧下降。证明了失去信号来源的ON-RBCs继发于感光细胞的变性出现急剧的数量上的缺失；3)RCS大鼠视网膜色素变性过程中，在以视锥细胞集中的后极部视网膜区域，因为仍然存在有感光细胞来源的信号输入，促进了ON-RBC的存活，并可能吸引了其他视网膜区域的ON-RBCs的迁徙；4)RCS大鼠视网膜色素变性过程中，树突形态发育不良，轴突终末分支减少，细胞呈现幼稚状态，同时双极细胞在网膜变性过程中向不同方向伸出mGluR6表达阳性的异常突起。在变性晚期，这些异常突起纠缠成结，并可见功能性突触存在的证据。说明变性网膜中的双极细胞为寻找新的信号传入具有一定的突触可塑性；5)RCS鼠视网膜ON-RBCs细胞的离子通道特性主要表现为去极化时的外向K+电流。在视网膜变性进程中，这种外向电流幅值均高于对照组，这揭示了ON-RBCs细胞在视网膜变性过程中功能状态的变化，ON-RBCs可能通过此改变对抗K+在胞体内中堆积，并反应了ON-RBCs信号传导功能的转变；6)在视网膜变性过程中，RCS大鼠在P60和P90d，其ON-RBCs的被动膜学特性以及在去极化时的外向型钾离子电流幅值和电流密度与对照组ON-RBCs和OFF-RBCs两者都不相似，存在显著差异。说明RCS大鼠的ON-RBCs在视网膜变性过程中发生了细胞膜上K+通道类型和数量以及功能活性发生改变，这种变构使其电生理特性异与任何一种类型的RBCs。