两性霉素B兔眼角膜基质内注射的安全性评价及在兔眼角膜和房水中药物浓度的实验研究

摘要

背景与目的：真菌性角膜炎是一种严重威胁视力的感染性角膜疾病，临床缺乏敏感、有效的抗真菌药物是此病治疗效果差的主要原因。多烯类抗真菌药物两性霉素B(Amphotericin B，AMB)对常见致病真菌属均敏感，是治疗真菌性角膜炎的一线用药选择。AMB通过角膜基质内注射或前房内注射治疗顽固的真菌性角膜炎已取得较好疗效，尤其当角膜深层溃疡波及内皮层或前房时。动物实验和临床研究均表明，前房内单次注射5～10ug的AMB对角膜、晶体、虹膜等未见明显毒副作用。本试验旨在探讨角膜基质内注射AMB对角膜有无毒性，寻找其安全范围的用药浓度，为临床应用提供实验依据；并探讨0.25％AMB去角膜上皮后滴眼、AMB角膜基质内注射、AMB前房内注射三种途径给药后，AMB在兔眼角膜和房水中的浓度变化，为真菌性角膜炎给药途径及合理的给药间隔选择提供实验依据。 第一部分、兔眼角膜基质内注射两性霉素B的安全性评价 目的：探讨兔眼角膜基质内注射AMB的安全性，寻找角膜基质内注射AMB的安全浓度。 方法： 1、健康白兔20只(40眼)按随机数字表法分为5组(每组8眼)。 2、A组：角膜基质内注射0.1ml平衡盐溶液(Balanced salt solution，BSS)；B、C、D、E组角膜基质内分别注射0.1ml浓度为5、10、15、20μg/0.1ml的AMB注射液。 3、每4d注射1次，共注射5次。在注射后的第1d、3d通过裂隙灯显微镜观察角膜透明性、上皮完整性、角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)生长情况，角膜超声测厚仪测量角膜厚度；第5次注射后30d，处死动物行角膜病理组织学检查，即苏木素和伊红染色(Hematoxylin and eosin，HE)，角膜内皮细胞活性率测定和内皮细胞超微结构观察，观察不同浓度的AMB角膜基质内注射对角膜有无明显毒副作用，寻找其注射的安全浓度。 结果： 1、浓度为5μg/0.1ml及10μg/0.1ml的AMB注射液兔眼角膜基质内注射后，角膜透明、上皮完整，角膜内皮细胞未见异常，与BSS组比较，未见显著差异(P>0.05)。 2、浓度为15μg/0.1ml及20μg/0.1ml的AMB兔眼角膜基质内注射后，角膜出现明显水肿，上皮脱落，严重的CNV长入，内皮细胞超微结构示细胞内空泡增多，线粒体肿胀，内皮细胞活性率降低，与BSS组比较，差异显著(P<0.05)。 结论： 1、角膜基质内注射直接将药物送达深层角膜，对角膜的机械创伤小、简单易行。 2、兔眼角膜基质内注射5、10μg/0.1ml浓度的AMB，即使操作间隔时间较短、次数较多，对角膜组织形态及生理功能仍未见明显损伤。 3、兔眼角膜基质内注射浓度为15、20μg/0.1ml的AMB，短期内如频繁注射，致角膜水肿，上皮脱落，CNV长入，内皮细胞受损，对角膜具有明确的毒性。其毒性随着药物浓度的增加而增加。 第二部分、两性霉素B经三种不同途径给药后在兔眼角膜和房水中药物浓度的实验研究 目的：探讨0.25％的AMB去角膜上皮后滴眼、10μg/0.1ml浓度的AMB角膜基质内注射及10μg/0.1ml浓度的AMB前房内注射三种途径给药后兔眼角膜和房水中的药物浓度变化。 方法： 1、健康白兔45只，按随机数字表法分为A、B、C三组(每组15只)。 2、A组、B组：分别在角膜基质内和前房内单次注射0.1ml浓度为10μg/0.1ml的AMB注射液；C组：去角膜上皮后0.25％的AMB滴眼(50μl/滴，1滴/次，1次/5min，共6次)。 3、分别于用药后30min、6h、1d、3d、7d，处死实验兔，获取房水和角膜组织，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)进行AMB的定量检测。 4、HPLC色谱条件：Waters高效液相色谱系统，510泵，Hypersil C18(200.0mm×4.6mm，5.0μm)色谱柱，流动相为乙腈：0.01mol/L磷酸二氢钠溶液(35:65，VN，100ml流动相含0.05ml三乙胺)，流速为1.0ml/min，紫外检测波长为380.0nm，采用外标法进行定量分析。 结果： 1、系统适应性实验：角膜匀浆液浓度在0.10～100.00μg/g范围内，房水浓度在0.10～50.00μg/ml范围内，AMB的峰面积与吸收度之间具有良好的线性关系。0.02μg/ml为AMB在该色谱条件下的检测限浓度，0.01μg/ml为其定量限浓度。房水的回收率范围在89.1％～95.7％，角膜为81.4％～83.6％。 2、角膜基质内注药组(A组)角膜中的药物浓度在30min、6h、1d高于前房内注药组(B组)及去角膜上皮滴眼组(C组)，差异有统计学意义(P<0.05)，高的药物浓度可持续7d，均显著超过AMB对镰孢菌、曲霉菌及念珠菌体外实验的MIC90[抑制90％受试菌株的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory，MIC)]。 3、前房内注药组(B组)房水中的药物浓度在30nun、6h、1d高于角膜基质内注药组(A组)及去角膜上皮滴眼组(C组)，差异有统计学意义(P<0.05)。 经三种不同途径给药后，在相同时间点，房水中的药物浓度均显著低于角膜中的药物浓度，仅B组30min时间点能超过AMB对绝大部分眼部分离真菌体外实验的MIC90，但1d内显著下降。其余房水中的药物浓度均低于AMB对绝大部分眼部分离真菌体外实验的MIC90。 4、去角膜上皮后采取频繁滴眼的方式，AMB在角膜和房水中能达到较高的浓度。 结论： 1、角膜基质内注射可以明显提高药物在角膜组织中的含量，单次注射后高药物浓度持续时间长达7d，提示临床给药间隔可以7d1次，无需短期内频繁注射。 2、前房内注射可以明显提高药物在房水中的含量，单次注射后30min内达到高的房水浓度，但1d内药物浓度迅速下降，提示病情凶险时可次日重复注射。 3、治疗轻、中度真菌性角膜炎，可选择去除角膜上皮频繁滴眼。 4、治疗顽固的深层真菌性角膜炎，辅助给予角膜基质内或前房内注射安全浓度和安全剂量的敏感抗真菌药物，可能是一种较好给药途径。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写一览表

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前 言

第一部分 兔眼角膜基质内注射两性霉素B的安全性评价

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

第二部分两性霉素B经三种不同途径给药后在兔眼角膜和房水中药物浓度的实验研究

物浓度的实验研究

材料与方法

结 果

讨 论

小 结

全文结论

致谢

参考文献

文献综述　真菌性角膜炎的临床治疗进展

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