血清因子白蛋白和补体在中枢神经系统损伤后炎症反应中的作用研究

摘要

目的:在包含创伤在内的中枢神经系统(Central nervous system,CNS)病变中,血脑屏障(Blood-brain barrier,BBB)的开放会引起多种血液成分进入CNS,进而可能在CNS引起相应的效应。而炎症反应是中枢系统微环境发生改变后的重要病理改变。研究发现BBB受损区域多伴有持续活化的炎症反应存在。而持续过度的炎症反应在许多中枢病变中都造成了损害性的后果。因此,探究BBB损伤性CNS病变中炎症反应持续激活的机制,设法对其进行调控,有可能达到降低损害,改善愈后的目的。
　　 血清白蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质,约占血清蛋白质总量的50％。但在CNS却近乎缺失。BBB损伤后大量的血清白蛋白进入CNS已被证实,然而其在中枢神经系统引起的效应却鲜有报道。因此,本实验将首次研究血清白蛋白作用于中枢神经系统主要的炎症效应细胞--小胶质细胞后对其活化增殖和分泌促炎症细胞因子的影响,明确其对中枢炎症反应的激活作用。
　　 补体系统是存在于人和脊椎动物血清与组织液中一组具有酶活性的蛋白,广泛参与机体的防御反应和免疫调节,也可介导免疫病理如损伤性炎症反应,是体内具有重要生物学意义的效应系统和效应放大系统。正常CNS中补体表达水平极低。研究发现血清中的补体成分在CNS损伤后穿过受损的BBB会介导和加重CNS的炎症反应;而炎症反应又是造成CNS损伤后继发性损伤和胶质瘢痕形成的重要机制。鉴于C3是补体活化途径中的中心因子,我们拟利用C3基因敲除小鼠的脊髓损伤模型,观察抑制补体活化能否减轻SCI小鼠脊髓的继发性损伤,促进功能恢复,并初步探讨其机制。
　　 方法:
　　 第一部分:小胶质细胞是存在于CNS的天然免疫细胞,当CNS微环境发生变化时,小胶质细胞可迅速活化增殖;而促炎症细胞因子IL-1β和TNF-α是介导CNS炎症反应的重要炎症介质。因此,我们以0.5mg/ml的血清白蛋白刺激N9小胶质细胞株,设PBS对照组,通过RT-PCR和Real-time RT-PCR方法检测干预后3、6、9、12h小胶质细胞IL-1β和TNF-α mRNA表达情况;分别以0、0.1、0.5、1.0、2.0mg/ml血清白蛋白和LPS刺激N9小胶质细胞,于24h收集各组细胞上清进行ELISA检测,测定IL一1β和TNF-α细胞因子的浓度,了解其对小胶质细胞分泌IL-1β和TNF-α作用的量效关系;以0.5mg/ml的血清白蛋白稀释液刺激N9小胶质细胞株,设PBS对照组,分别于3、6、12、24h收集血清白蛋白刺激组和PBS对照组细胞上清进行ELISA检测,测定IL-1β和TNF-α细胞因子的浓度,了解其作用的时间特点;将0.5μl100mg/ml血清白蛋白注入C57BL/6J小鼠运动皮层,采用免疫组化法在体观察白蛋白作用后小胶质细胞的活化程度。
　　 第二部分:为准确判断干预手段对脊髓损伤后功能结局的影响,我们需要稳定、重复性好、易操作的动物模型作为研究平台。由于目前的基因修饰动物以小鼠为主,因此我们以C57BL/6J小鼠为实验动物,建立脊髓夹伤模型,并对其特点进行评价,为下一步的研究奠定基础。我们采用BMS后肢运动评分观察夹伤致0.1、0.25、0.5mm的不同分级损伤程度对小鼠后肢功能损伤及恢复的影响;并以HE染色观察不同损伤程度致脊髓损伤后8w时脊髓的病理表现;以HE染色观察SCI后小鼠脊髓3d、1w、2w、4w时脊髓的病理改变特点;以GFAP免疫组织化学染色观察SCI后3d、1w、2w、4w、8w时小鼠脊髓星形胶质细胞反应特点;以BDA顺行示踪观察小鼠SCI后8w神经纤维再生特点及其与胶质瘢痕的关系;以流式细胞计数法检测SCI后3d、1w、2w、8w的小胶质细胞/巨噬细胞的活化特点。
　　 第三部分:采用上述建立的小鼠脊髓夹伤模型,以C3-/-小鼠及其野生对照C3+/+小鼠为实验动物,通过BMS评分评估后肢运动功能、HE染色观察脊髓病理改变、流式细胞术检测小胶质细胞/巨噬细胞活化、免疫组化和Western blot技术检测星形胶质细胞GFAP表达,观察对比C3基因敲除对小鼠SCI后功能恢复的影响并初步探讨其机制。
　　 结果:
　　 第一部分:
　　 1.与PBS对照组细胞相比,0.5mg/ml的血清白蛋白刺激的小胶质细胞3、6、9、12h的IL-1β和TNF-α mRNA表达均显著增加;
　　 2.0.1、0.5、1.0、2.0mg/ml白蛋白刺激24h后小胶质细胞培养上清中IL-1β、TNF-α的浓度随血清白蛋白浓度的增加而增加,2.0mg/ml刺激组IL-1β、TNF-α浓度最高;各白蛋白刺激组IL-1β浓度和TNF-α浓度均显著高于0mg/ml组;LPS刺激组亦显著高于未刺激组。
　　 3.0.5mg/ml的血清白蛋白作用后,小胶质细胞分泌IL-1β随时间增加而增多,且于6h后各时间点均显著高于对照组;小胶质细胞分泌TNF-α随时间增加而增多,且于3h开始及其后时间点均显著高于对照组。
　　 4.小鼠皮层注射血清白蛋白引起小胶质细胞活化的范围和数量明显强于PBS对照组。
　　 第二部分:
　　 1.成功建立了稳定的C57BL/6J小鼠脊髓夹伤动物模型,BMS评分检测显示SCI后各组小鼠后肢运动功能有不同程度损伤,之后持续8w的行为学观察中虽都有恢复,但不同致伤程度组小鼠恢复情况有显著性差异。夹伤越轻(至0.5mm),恢复越好;夹伤越重(至0.1mm),恢复越差。
　　 2.不同致伤程度小鼠8w时的脊髓病理改变与行为学结果相符。夹至0.1mm组小鼠的脊髓损伤范围最广,可见夹伤处大量炎细胞浸润形成的瘢痕及微小的空洞形成;随着夹伤程度的减弱,瘢痕的范围逐渐减小,残留的正常组织逐渐增多。
　　 3.损伤后4w的连续病理观察发现:伤后3d,脊髓以变性、坏死为主要表现;1w时已有大量炎细胞浸润,并且出现继发性损伤区域,可见损伤两侧水肿形成较多空泡;2w时仍有大量炎细胞浸润,继发损伤和水肿区域较1w时缩小;4w时仅残留炎细胞浸润,继发损伤表现明显减弱,组织进入修复期。
　　 4.损伤后8w的星形胶质细胞连续观察发现:伤后3d,星形胶质细胞尚未有明显的活化表现;1w时星形胶质细胞肥大,突起增粗增长,呈明显的活化状态,范围延伸至损伤区的头尾两侧;2w时星形胶质细胞的数量较1w时有所增多,但是细胞及突起的形态已不如7d时肥大明显;4w和8w时星形胶质细胞的活化程度和范围明显减弱,但在损伤中间处瘢痕组织的周边仍包绕有较多形态肥大,突起增多的反应型星形胶质细胞形成胶质瘢痕,而稍远处的星形胶质细胞形态已基本接近正常。
　　 5.BDA顺行示踪发现SCI后10w+2d,夹伤至0.25mm组小鼠脊髓中,大部分BDA标记的皮质脊髓束到达夹伤处的头侧端,但是无法继续下行,在夹伤处头侧端形成多个圆形的终球,仅有少数BDA着色的神经纤维在原皮质脊髓束位置的背侧方通过夹伤处,到达夹伤处尾侧端。经GFAP复染后,可见BDA终球形成位置恰为星形胶质细胞肥大增生形成胶质瘢痕处。
　　 6.流式细胞术检测CD68阳性细胞提示损伤处小胶质/巨噬细胞于伤后3d即明显活化增殖且3d时活化状态已很强,其数量在7d达到高峰后,一直持续到伤后8w均存在活化状态的小胶质/巨噬细胞。
　　 第三部分:
　　 1.BMS评分显示C3-/-小鼠夹伤后的后肢功能恢复明显好于C3+/+组小鼠。
　　 2.HE染色提示夹伤后4w,C3-/-小鼠脊髓损伤处的炎症细胞浸润形成瘢痕的范围明显少于C3+/+组小鼠,而残留的正常组织却要多于C3+/+小鼠。
　　 3.流式细胞检测CD68阳性细胞提示伤后3d、7d,C3-/-小鼠损伤处的小胶质/巨噬细胞活化程度明显弱于C3+/+组小鼠。
　　 4.免疫组化和Western blot检测均提示C3-/-小鼠伤后4w GFAP的表达明显弱于C3+/+组小鼠。
　　 结论:
　　 1.本研究证实血清白蛋白能刺激小胶质细胞的活化增殖,并能促进其分泌IL-1β、TNF-α促炎症细胞因子,提示血清白蛋白在CNS炎症反应中可能起重要的活化作用。
　　 2.本研究建立了稳定、易操作、重复性好的小鼠SCI模型,既适用于SCI急性期小胶质细胞活化炎症反应的研究,也可用于SCI慢性期星形胶质细胞形成胶质瘢痕及神经再生的研究。
　　 3.补体系统可能通过加重炎症反应,并促进星形胶质细胞瘢痕的形成,对小鼠脊髓损伤的修复产生不利影响。
　　 综上所述,本文通过对血清白蛋白和补体的研究,进一步丰富了血清因子对中枢神经系统损伤后炎症反应作用的认识,并为通过干预炎症反应治疗中枢神经系统病变提供了理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

前言

第一部分 血清白蛋白促进小胶质细胞分泌促炎症细胞因子及活化增殖的作用研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第二部分 小鼠脊髓夹伤模型的建立及评价

材料与方法

结果

讨论

参考文献

第三部分 C3基因敲除对小鼠脊髓损伤后后肢功能恢复的影响及机制研究

材料与方法

结果

讨论

参考文献

全文总结

致谢

文献综述 小胶质细胞的活化及其机制探讨

博士在读期间发表文章

英文论著