miR-223调控Lewis肺腺癌转移性干细胞恶性表型的分子机制研究

摘要

肺癌是威胁人类健康的最常见恶性肿瘤,尽管放化疗和手术方法不断进展,但作为常见组织类型的非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)总的5年生存率仍不足15％,其根本原因在于残余肿瘤细胞对现有治疗手段的抗拒。新近癌干细胞理论的建立给抗肿瘤治疗提供新的研究方向。癌干细胞是肿瘤细胞中一个特殊的亚群,其突出特征是具有自我更新和不断分化的能力,并与肿瘤细胞原发耐药、新生血管形成乃至远处转移等肿瘤演进过程密切相关。目前认为,癌干细胞具有独特的恶性表型,与非癌干细胞有着不同的表面分子标志,在基因表达谱和蛋白质表达谱上也有较为显著的差别。
　　 微RNA(MicroRNA,miRNA)是一类小的非编码RNA,长度为18～25bp,它能通过与靶mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)结合,抑制mRNA的翻译或影响mRNA的稳定性,在转录或转录后水平调控编码蛋白基因的表达。组织或细胞在某个特定阶段存在自身特异的miRNA表达谱,可作为其特征性分子标志;关键miRNA参与干细胞自我更新、多向分化等特性的调控,并决定细胞的分化方向以及分化进程。因此,研究miRNA对肺癌干细胞恶性表型的调控作用,就可能提供有效治疗肺癌的方法。
　　 目的:
　　 1.从小鼠Lewis lung carcinoma(LLC)细胞系中寻找Sca-1、CXCR4双阳性细胞,并验证其是否具有癌转移性干细胞特性。
　　 2.比较细胞分化相关miRNA在CXCR4阳性与阴性LLC细胞中的表达差异,并对差异表达显著的miR-223进行生物信息学初步研究。
　　 3.将miR-223真核表达载体转染至LLC细胞中,评价miR-223对LLC细胞恶性表型的调控作用及其分子机制。
　　 方法:
　　 1.流式分析Sca-1、CXCR4双阳性细胞比例,激光共聚焦检测小鼠肺癌组织中双阳性细胞表达情况;以CXCR4作为磁珠分选细胞的表面标志,检测分选前后细胞活性,观察分析CXCR4阳性亚群的恶性生物学行为。
　　 2.Trizol法抽提细胞总RNA,实时荧光定量PCR(TaqMan探针)检测miRNAs表达,对表达差异最为显著的miRNA进行潜在靶基因预测,应用RT-PCR、免疫组化方法初步分析具有研究价值的关键分子在两个不同亚群细胞及移植瘤组织中的表达情况,并通过BLAST对其3'非翻译端(3'-untranslated region,3'-UTR)进行直向同源基因序列比对分析。
　　 3.构建miR-223真核表达载体,转染后通过细胞划痕、Transwell侵袭实验观察其对LLC细胞侵袭迁移能力的影响,流式细胞仪分析LLC细胞周期分布变化,ELISA检测MMP9、VEGF表达水平,实时定量PCR、western blot检测预测靶基因或通路蛋白表达情况。
　　 主要结果:
　　 1、LLC细胞中Sca-1、CXCR4双阳性细胞比例为0.1％,CXCR4阳性细胞为0.18％,小鼠肺癌组织存在荧光双染色细胞;分选前细胞活性为(95.58±0.87)％,分选后活力为(94.96±0.76)％(P＞0.05);CXCR4阳性亚群在无血清中呈球状生长,CCK-8法显示增殖能力明显高于阴性亚群(P＜0.05);CXCR阴性亚群1×105即不可成瘤,CXCR4阳性亚群在7×103仍可成瘤。
　　 2、CXCR4阳性LLC多毗邻内皮细胞,周围形成血管样结构;CXCR4阳性LLC的VEGF mRNA表达(0.440±0.006)明显高于CXCR4阴性LLC(0.290±0.003)(P＜0.01);CXCR4阳性LLC移植瘤组织MVD(56.87±4.83),明显高于CXCR4阴性LLC移植瘤(43.52±4.91)(P＜0.01)。
　　 3、CXCR4阳性亚群组微膜下细胞数为109.67±20.03个,显著高于CXCR4阴性亚群组的53.67±13.01个,差异具有统计学意义(P＜0.05),CXCR4阳性亚群MMP9mRNA表达(0.622±0.014)明显高于CXCR4阴性亚群(0.579±0.017)(P＜0.05);CXCR4阴性和阳性亚群分别以5×105、2×104密度各接种3只小鼠,前者无转移,而后者2只发生肺转移,1只发生耳转移。
　　 4、CXCR4阳性与阴性LLC比较,具有对顺铂更强的抗拒性(P＜0.05);CXCR4阳性LLC的ABCG2 mRNA表达(0.524±0.008)明显高于CXCR4阴性LLC(0.387±0.007)(P＜0.01)。
　　 5、CXCR4阳性与阴性LLC比较比较,各检测miRNA表达均较低,其中以miR-223差异最为显著(Fold Change=8.26),通过软件分析预测,miR-223与IGF1R、IGFBP5、Pik3cb、ELK-1和E2F1等基因均具有可能靶位点,CXCR4阳性LLC的IGF1R mRNA表达(0.421±0.007)明显高于CXCR4阴性LLC(0.185±0.007)(P＜0.01),免疫组化检测发现CXCR4+亚群种植瘤组织IGF1R表达显著高于CXCR4阴性亚群,IGF1R mRNA3'-UTR的238～244和688～695nt两个结合位点具有高度的进化保守性。
　　 6、miR-223重组质粒转染48小时后,细胞划痕实验显示LLC细胞迁移(218.67±39.80μm),与正常对照组(341.67±35.92μm)比较,迁移能力显著受抑(P＜0.05);Transwell迁移实验显示微膜下细胞数为(60.67±12.66个),与正常对照组(100.33±14.01个)比较,侵袭能力明显下降(P＜0.05);ELISA检测MMP9浓度为(214.16±28.18pg/mL),与正常对照组(1139.14±50.13pg/mL)比较,差异非常显著(P＜0.01);流式细胞周期检测发现G0/G1细胞减少(53.8％→45.3％),G2细胞增加(4.29％→13.2％)。
　　 7、miR-223重组质粒转染48小时后,实时定量PCR结果显示IGF1R、CXCR4、CDK2等预测靶基因及MMP9 mRNA表达分别下调大约17、12、25和15倍,与正常对照组比较,差异非常显著(P＜0.01);western blot结果显示预测靶基因蛋白表达也明显减少,IGF1R下游Akt、Erk信号通路明显下调。
　　 结论:
　　 1、Lewis肺癌细胞中的CXCR4阳性亚群具有一定的自我更新和转移能力,具备癌转移干细胞某些特性,Sca-1、CXCR4可以作为小鼠肺腺癌转移性干细胞的表面标志。
　　 2、miR-223在CXCR4阳性LLC细胞中显著低表达,生物信息学预测其可能与肺腺癌细胞IGF1R信号通路调控有关。
　　 3、miR-223过表达时,IGF1R、CXCR4、CDK2等预测靶基因表达均下调,IGF1R下游Akt、Erk通路也下调,效应分子VEGF、MMP9分泌减少,LLC细胞侵袭迁移能力明显受抑、G0/G1细胞比例下降;表明miR-223广泛参与了LLC细胞IGF1R信号通路调控。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写一览表

前言

第一部分 CXCR4阳性LLC细胞的转移性干细胞特性研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 miR-223在CXCR4阳性LLC细胞的表达及其参与癌细胞转移的生物信息学分析

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 miR-223过表达抑制LLC细胞侵袭转移及其分子机制研究

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

致谢

参考文献

文献综述一 肿瘤干细胞研究进展及其临床应用前景

文献综述二 蛋白组学在临床肿瘤学研究中的应用及进展

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