基于APE1和p53蛋白序列的多肽阵列设计及其线粒体定位序列的筛选

摘要

线粒体是人类细胞中除细胞核外唯一具有基因组DNA的细胞器,线粒体DNA(mtDNA)极易受到氧化应激的损伤。氧化应激与多种病理状态密切相关,包括癌症、衰老和心血管疾病等。DNA是氧化应激损伤的重要靶分子之一,形成的DNA氧化性损伤主要经碱基切除修复(BER)进行修复。APE1和抑癌基因p53为经典的核一线粒体双定位蛋白。研究表明,在未受到任何刺激情况下,二者主要定位于细胞核,当发生氧化还原后APE1和p53均发生线粒体易位,证明二者都参与了DNA的损伤修复过程。近来研究发现,APE1/Ref-1刺激大量与癌症发病有关的转录因子的DNA结合活性,如AP-1的(Fos/Jun)、缺氧诱导因子-1A(HIF-1a)、CREB蛋白、p53等。近来发现,野生型p53蛋白是一种负调节APE1表达的调控子,通过干扰APE1的结合位点Sp-1调控其表达下调。P53抑制APE1的表达将为我们进一步探讨APE1在DNA损伤修复中的作用是否依赖p53介导的细胞凋亡途径提供一条新的研究思路。
　　 作为BER途径的重要限速酶人脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶(APE1)在细胞氧化应激反应中起中心作用。APE1的亚细胞定位可在某些代谢率或增殖率很高的细胞的胞质中,主要定位于线粒体和内质网(ER),且APE1的线粒体靶向定位是有先决条件的,即发生氧化应激反应后APE1会靶向定位线粒体,而定位于线粒体上p53足以引起线粒体水平上p53依赖的细胞凋亡。由于双定位的核一线粒体蛋白通常拥有一个非常规的线粒体定位序列(MTS),传统的生物信息学方法无法确定其具体位置。因此,APE1和p53的线粒体定位序列尚不清楚。具体线粒体膜易位酶与蛋白质进入线粒体密切相关,蛋白质进入线粒体必须经过两个易位接触位点,即核编码的线粒体定位前体蛋白需要与线粒体表面受体识别,然后与线粒体外膜易位酶(translocase of the outermembrane,TOM)形成复合体通道(GIP)将线粒体定位蛋白外膜上。而TOM复合体主要由Tom20、Tom22和Tom70三个亚基构成,主要负责转运内部具有信号序列的蛋白,通过外膜,进入膜间隙。每个输入受体均能结合线粒体前体蛋白,但结合特性不同。Tom20和Tom22是异二聚体受体,是转运携带裂解N-端线粒体定位序列(MTS)的典型的线粒体前体蛋白。Tom70是负责将线粒体非裂解前体蛋白向内膜转运所必须的特异受体蛋白。
　　 本课题组重点研究基于APE1和p53蛋白序列的多肽阵列设计及其MTS的筛选,旨在进一步揭示DNA损伤修复通路中二者的线粒体易位机制。本课题拟联合运用分子生物学、细胞生物学、生物化学及生物信息学的技术方法,建立肽库并利用搭建好的肽库筛选APE1和p53的MTS。首先使用分子生物学手段构建一系列的融合蛋白质粒,转化E.coli表达、纯化Tom20、Tom22和Tom70。采用每15个小肽为单位,构建APE1和p53的肽库微阵列芯片。然后通过杂交反应,确定MTS的可能的区域。根据肽库筛选的结果,拟构建相应的截短型APE1融合GFP质粒,转化Hela细胞,激光共聚焦显微镜观察,融合蛋白的亚细胞定位情况。Pull down试验进一步确定APE1和p53的亚细胞定位的准确性。寻找到特异的区域后,通过定点突变的方法,对MTS进行功能确认。这为今后鉴定p53和APE1线粒体定位序列,设计阻断多肽抑制其线粒体定位提供理论依据,为通过以p53基因介导抑制线粒体APE1的表达为靶点,对肿瘤细胞的药物敏感性提供一个潜在基因治疗方法和可行策略。
　　 主要结果如下:
　　 1.构建了线粒体外膜受体蛋白Tom20、Tom22和Tom70的三种His-10 tag重组质粒,pET19b-yTom20cd-His10、pET19b-yTom22cd-His10和pET19b-yTom70cd-His10,转化E.coli,IPTG诱导蛋白表达。
　　 2.SDS-PAGE,考马斯亮蓝R250染色确定三种蛋白的诱导,使用His标签蛋白纯化树脂(Ni-NTA Resin)纯化三种蛋白。Bradford法测定纯化后的蛋白浓度。使用HRP标记的His抗体,Western blot检测三种融合蛋白。得到纯度和浓度较高的融合蛋白,进行后续的亲和试验。
　　 3.激光共聚焦显微镜观察刺激前后APE1的亚细胞定位。结果表明:APE1主要定位在HeLa细胞的细胞核,在氧化应激或维生素K3诱导后APE1易位到线粒体。分离各组分(细胞核、线粒体、胞浆)蛋白,Western blot进一步验证了APE1的定位。
　　 4.构建APE1的肽库微阵列芯片。纯化后的三种TOM蛋白分别与APE1的肽库微阵列芯片杂交,通过Spotfinder软件提取数据,SAM3.02、Cluster3.0分析数据。结果显示,APE1与Tom20的亲和力明显强于Tom22和Tom70。主要分布在APE1的N-端和C-端的前三分之一区域,筛选出可能的MTS区域位于:峰值区域包括残基211-240,238-258,265-279以及289-312。
　　 5.三种TOM蛋白与APE1的pull down试验,进一步确认,Tom20与APE1的结合力最强。提示:APE1的线粒体易位可能通过Tom20的依赖途径。
　　 6.在本实验室成功构建了以GFP为报告基因的亚细胞定位系统。激光共聚焦显微镜观察到野生型的p53定位于细胞核中,线粒体特异蛋白转录因子A(TFAM)定位于线粒体中。表明该系统采用融合GFP以指示被融合蛋白的定位是可行的。
　　 7.同样方法构建p53的肽库微阵列芯片,三种TOM蛋白杂交后的结果表明:APE1与Tom20的亲和力明显强于Tom22和Tom70。提示p53的线粒体易位也可能通过Tom20的依赖途径。通过Spotfinder软件提取数据,SAM3.02、Cluster3.0分析数据结果,筛选出可能的MTS区域位于:351-365,358-372,365-379及372-386,为后续的试验提供支持。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩写索引

前言

第一部分 线粒体外膜受体蛋白表达载体的构建及纯化

材料与方法

结果

讨论

第二部分 双定位蛋白APE1多肽阵列设计及其MTS肽库筛选

材料与方法

结果

讨论

第三部分 p53蛋白多肽阵列设计及其MTS肽库筛选

材料与方法

结果

讨论

全文结论

问题与展望

致谢

参考文献

文献综述 APE1/Ref-1线粒体定位机制的研究

博士在读期间发表的论文