内皮祖细胞移植修复肺血管内皮炎症损伤的实验研究

摘要

背景与目的：
　　 急性肺损伤(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distresssyndrome,ARDS)是临床常见的疾病,是由感染、创伤、中毒、失血等病因导致的全身失控性炎症反应,以肺血管内皮细胞、肺泡上皮细胞广泛坏死、凋亡及功能失调,肺泡--毛细血管膜损伤、通透性增加、肺内大量蛋白和炎症细胞因子渗出为其临床病理特征[1～3],其发病率和死亡率高;文献报道ALI/ARDS中有近50％肺血管受损及功能失调[4,5]。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一类可以分化为成熟内皮细胞的前体细胞,不仅参与人胚胎血管的形成,同时也参与出生后血管形成、再内皮化和组织损伤后的修复过程。随着内皮祖细胞移植在心血管疾病、缺血性损伤、抗肿瘤血管生成中的研究、应用[6,7],近年来国外学者开始探索EPCs在炎症疾病中的作用。国外研究发现在肺炎、脓毒症患者外周血中EPCs数量显著增加,且与预后成正相关。Suratt[8]等报道在接受异体供体的造血干细胞移植后,受体的肺组织可检测到供体衍生的内皮细胞,且内皮细胞嵌合的发生率为37.5％～42.3％;这些研究提示,EPCs对维持炎症组织、维持血管的完整和重建具有重要作用,为ALI/ARDS的治疗提供了新的思路。
　　 本实验采用密度梯度离心的方法,经体外培养、鉴定,成功分离出大鼠的骨髓EPCs;以此为基础,在LPS诱导的雌性大鼠ALI模型中,经静脉移植同种异体的雄性的EPCs,通过原位杂交、RT-PCR方法检测Y染色体来检测EPCs在雌性肺组织中的嵌合情况,同时观察对肺组织的病理结构及肺血管膜通透性的影响,并采用ELISA、Western blot检测移植EPCs后对细胞因子TNF-α、IL-10及对内皮素-1(endothelin-1,ET-1)、诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthetase,iNOS)的影响,以探讨EPCs在ALI/ARDS治疗中的作用,为ALI/ARDS的内皮细胞靶向治疗提供实验依据。
　　 实验方法
　　 1、分离、培养、鉴定EPCs:采用密度梯度离心法分离SD大鼠的骨髓EPCs,接种在纤维连接蛋白包被的含20％胎牛血清的DMEM培养基的培养瓶内培养。培养7～10天后采用免疫荧光检测EPCs摄取乙酰化低密度脂蛋白、结合凝集素的能力,并检测内皮细胞特异性抗原CD133、CD34、VEGFR-2、vWF的表达来鉴定EPCs。
　　 2、用Y染色体特异性基因sry来检测大鼠骨髓EPC移植后在肺组织中的表达及定位:ALI模型通过LPS静脉给药诱导,致伤半小时后,EPC移植组雌性大鼠经右侧颈静脉注入同遗传背景的雄性大鼠来源的EPCs悬液(2×106/0.5ml),分别于移植后3,7,14天取肺组织,采用ISH和RT-PCR方法检测各组肺组织中Y染色体的sry基因的表达。
　　 3、探讨EPC移植对肺血管内皮炎症损伤的修复作用:在另一实验中,动物随机分为四组:PBS对照组、EPC对照组、PBS处理组和EPC处理组;EPC处理组和PBS处理组在LPS致伤后分别给予EPCs或等量的PBS;EPC对照组和PBS对照组则分别给予EPCs或PBS,但不给与LPS诱导肺损伤;7天后取各组肺组织,采用HE染色、免疫组织化学的方法评估EPC移植后的病理改变及微血管密度的变化;并检测肺组织的干/湿比值(W/D)及大鼠的存活率,细胞因子IL-10、TNF-α的表达水平,同时采用Western blot方法评估ALI的生物标记物ET-1、iNOS的表达。
　　 4、统计学分析:所得结果用医学图像分析系统测定其灰度值,所得数据用均值±标准差(mean±SD)表示。用SPSS13.0对数据进行处理,两组间比较用t检验;多组间进行单因素方差分析,用Tukey's方法进行组间比较。以P＜0.05表示差异具有统计学意义,P＜0.01表示统计学差异非常显著。
　　 结果
　　 1.鉴定EPCs:培养7天后,早期的EPCs能摄取乙酰化低密度脂蛋白、结合凝集素,并表达内皮细胞特异性的标志物CD133、CD34、vWF和VEGFR-2;在含20％胎牛血清DMEM培养基中培养一周后能形成圆形、梭形的细胞表型。
　　 2.在细胞移植7天组和14天组的ALI雌性大鼠的肺组织中分别可检测到雄性来源的同种异体的EPCs,且EPCs主要定位在内皮系统;但在细胞移植3天组ALI雌性大鼠肺组织中未检测到雄性来源的同种异体的EPCs。
　　 3.EPC移植可显著减少炎症细胞的浸润、肺组织出血及透明膜的形成,降低炎症反应状态;降低肺组织的肺W/D比值,减轻肺水肿;同时促进血管生成,增加微血管密度,改善ALI大鼠的存活率;增加抗炎细胞因子IL-10的表达;同时下调TNF-α、ET-1和iNOS的表达。
　　 结论
　　 本研究主要结论:1、采用密度梯度离心法,经体外培养、鉴定,成功分离出大鼠的骨髓EPCs2、EPC静脉移植7天后能成功嵌合到LPS致伤的大鼠肺组织,并分化为内皮表型;3、在LPS诱导的ALI大鼠模型中EPC移植可显著缓解肺损伤,改善生存率;EPC移植的防治效果可能与修复损伤的肺血管内皮系统,维持肺泡--毛细血管膜的完整性、减轻炎症反应有关。这些结果表明EPC移植能改善LPS诱导的大鼠急性肺损伤,为ALI/ARDS治疗提供新的思路。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

前言

第一部分 大鼠骨髓内皮祖细胞的分离、培养、鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二部分 移植的内皮祖细胞在受体肺组织中的检测

材料与方法

实验结果

讨论

第三部分 内皮祖细胞移植对肺血管内皮炎症损伤的修复作用观察

材料与方法

实验结果

讨论

全文结论

致谢

照片

参考文献

文献综述一 急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征的治疗进展

文献综述二 内皮祖细胞移植在急性肺损伤治疗作用中的展望

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