结缔组织生长因子、转化生长因子β1在幼年及成年兔膝关节软骨全层缺损修复中的表达及意义

摘要

1.背景与目的:
　　 关节软骨损伤在临床上较为常见,对于损伤修复的研究一直以来都是一个巨大的挑战。关节软骨属于透明软骨,是一种特殊的结缔组织,软骨内无血管、淋巴管和神经,其营养主要由滑液供应,这些结构特点决定了损伤后自身愈合能力有限。
　　 有研究报道,幼年新西兰白兔膝关节软骨全层缺损后可形成透明软骨修复,新生的软骨组织在组织结构等方面和正常关节软骨无明显差异,而成年新西兰白兔膝关节软骨全层缺损后只能形成纤维组织修复。幼年与成年兔修复结果的差异,说明修复机制存在差异。关节软骨损伤后,良好修复的关键在于:诱导损伤关节软骨细胞的增殖和分化,促进基质蛋白多糖和胶原的产生。生长因子是促进这些过程的重要因素。
　　 结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)有刺激间充质细胞向软骨细胞分化的潜能,能促进软骨细胞的增殖和分化,可促进兔关节软骨细胞Ⅱ型胶原及蛋白多糖核的表达,有研究证实在小鼠体内它能促进损伤关节软骨的再生;转化生长因子-β1(transforming growth factor,TGF-β1)具有将骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的潜能,可促进软骨细胞的增殖,刺激关节软骨糖胺聚糖(GAG)和Ⅱ型胶原的生成。成年和幼年兔关节软骨全层缺损修复过程中CTGF、TGF-β1的表达是否存在差异缺乏研究报道。
　　 本实验通过建立幼年和成年新西兰白兔膝关节软骨全层缺损动物模型,在缺损后自我修复的不同时间点观察修复组织的大体形态、组织学形态,检测修复组织中Ⅱ型胶原、CTGF、TGF-β1的表达,分析CTGF、TGF-β1在成年和幼年兔修复过程中表达的差异,探讨软骨缺损修复的质量与CTGF、TGF-β1表达量的关系,探讨幼年兔软骨损伤修复的机制,为关节软骨损伤的治疗提供理论论据。
　　 2.方法:
　　 成年和幼年新西兰白兔各25只,两年龄组兔分别随机分为5组(n=5):A:对照组(未损伤组)、B:损伤24h组、C:损伤1周组、D:损伤4周组、E:损伤8周组。制备兔膝关节股骨关节面全层软骨缺损自我修复模型。术后于各时间点处死动物,观察软骨缺损修复的大体形态,苏木素/伊红(HE)染色观察修复组织的组织病理学形态,RT-PCR检测Ⅱ型胶原、CTGF、TG-β1 mRNA在成年和幼年兔软骨修复组织中的表达,应用图像分析技术进行PCR产物电泳条带光密度分析,以平均光密度值表示其条带的相对数值,将目的基因平均光密度值/内参基因平均光密度值得到各例标本目的基因的相对表达量,应用免疫组化技术检测修复过程中软骨内CTGF、TGF-β1蛋白的表达。采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析,以p＜0.05为差异有统计学意义。
　　 3.结果:
　　 损伤后1周时成年组和幼年组缺损均未完全填充;4周时两年龄组缺损较1周时有更多的修复组织;8周时幼年组缺损均完全被填充,修复组织表面较光滑,表面颜色由淡红逐渐转白,成年组仅少数标本填充完全。
　　 光镜下观察,4周时成年和幼年兔修复组织都没有达到周围软骨的高度,幼年组,修复组织主要为纤维组织和未完全分化的间充质,成年组,修复组织以纤维组织为主;8周时幼年组修复组织充盈,成年组仅有少数标本的再生组织达到周围正常软骨的高度,幼年组大部分标本中发现透明样软骨,在成年组,修复组织为纤维组织或者是未完全分化的间充质。
　　 CTGF、TGF-β1及Ⅱ型胶原mRNA在软骨缺损修复过程中持续表达。Ⅱ型胶原mRNA相对表达量,幼年兔:A0.604±0.005,B0.813±0.005,C1.091±0.006,D0.650±0.002,E0.741±0.002,成年兔:A0.039±0.004,B0.195±0.004,C0.604±0.006,D0.095±0.005,E0.087±0.003。CTGF mRNA相对表达量,幼年兔:A0.350±0.014,B0.719±0.012,C0.864±0.010,D0.442±0.009,E0.438±0.010,成年兔:A0.119±0.009,B0.509±0.011,C0.519±0.009,D0.348±0.010,E0.227±0.008。TGF-β1 mRNA相对表达量,幼年兔:A0.619±0.010,B0.969±0.012,C1.099±0.037,D0.730±0.011,E0.723±0.013,成年兔:A0.313±0.013,B0.873±0.021,C0.970+0.010,D0.535±0.020,E0.415±0.010。
　　 幼年兔和成年兔损伤后各组Ⅱ型胶原、CTGF、TGF－β1 mRNA的表达高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 修复过程中幼年组Ⅱ型胶原、CTGF、TGF－β1 mRNA的表达高于成年组,差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 Ⅱ型胶原与TGF-β1 mRNA的表达量呈正相关,Ⅱ型胶原与CTGF mRNA的表达量呈正相关,CTGF与TGF-β1 mRNA的表达量呈正相关(P＜0.05)。
　　 免疫组化结果显示修复过程中关节软骨细胞内均有CTGF、TGF-β1蛋白的表达。
　　 4.结论:
　　 1、关节软骨损伤后,幼年兔修复组织较成年兔修复组织有更明显的关节软骨组织特异性,幼年组Ⅱ型胶原mRNA表达量较成年组显著增高,提示幼年兔修复组织的质量优于成年兔。
　　 2、CTGF、TGF-β1 mRNA在成年兔和幼年兔关节软骨全层缺损修复过程中持续表达,损伤后各组表达量较对照组显著增高,提示CTGF、TGF-β1参与软骨缺损后自我修复过程。
　　 3、修复过程中幼年组CTGF、TGF-β1 mRNA表达量较成年组显著增高,提示CTGF、TGF-β1表达量的高低与关节软骨修复的质量密切相关。CTGF、TGF-β1的高表达状态可能是幼年兔软骨缺损得以良好修复的重要因素之一,将CTGF、TGF-β1应用于关节软骨损伤的治疗,可能更好的促进关节软骨损伤的修复。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:英文缩略词表

前言

实验材料与方法

结果

讨论

图片

结论

致谢

参考文献

文献综述一 结缔组织生长因子在软骨中的作用

文献综述二 关节软骨损伤修复的研究现状

研究生在读期间发表的论文