脉冲电磁场对脱钙骨基质诱导人骨髓间充质干细胞增殖与成骨分化的影响

摘要

背景和目的:脱钙骨基质(Demineralized Bone Matrix,DBM)具有在体外促进人骨髓间充质干细胞(human Mesenchymal Stem Cells,hMSCs)增殖与成骨分化,在体内促进新骨形成的能力,在临床组织工程中具有广泛应用价值。hMSCs具有良好的成骨细胞分化潜能和成骨活性,是骨组织工程种子细胞的最佳选择之一,hMSCs与DBM共同培养,与DBM释放的可溶性骨生长因子接触后,能加速自身的增殖与成骨分化。
　　 脉冲电磁场(pulsed electromagnetic fields,PEMF)在矫形外科领域主要用于治疗骨不连、骨延迟愈合及假关节形成等并已经取得成功。特定频率、特定场强的PEMF能够刺激成骨细胞增殖、分化,并可刺激局部骨生长因子的产生,加速骨基质矿化,该现象已被国内外学者们证实。然而有关PEMF和DBM共同刺激hMSCs增殖与成骨分化的具体生物学作用研究尚未见报道。
　　 本研究将观察PEMF对DBM诱导hMSCs在体外培养时细胞增殖与成骨分化的影响,探讨PEMF影响组织工程材料中hMSCs成骨分化的可能机制,为骨组织工程提供新的技术手段。
　　 方法:
　　 1.经知情同意后,选取因股骨颈骨折行髋关节置换术患者的股骨头。
　　 2.将股骨头锯成3mm×5mm×5mm大小的骨粒,按Urist b法制作成DBM。用扫描电镜观察材料的形态并测量材料孔径,能谱仪检测DBM钙含量。
　　 3.获取健康志愿者的骨髓,分离、培养hMSCs,进行原代和传代培养。鉴定hMSCs的表面抗原标志物CD44和CD105。
　　 4.第3代hMSCs以1×104个/孔接种至8块24孔板,以1×105个/孔接种至2块加盖玻片的6孔板,各分成4组:细胞对照组(cell,C组)、细胞+材料组(cell-DBM,CD组)、细胞+脉冲电磁场组(cell-PEMF,CP组)、细胞+材料+脉冲电磁场组(cell-DBM-PEMF,CDP组),其中CD组和CDP组培养板每孔放入一块DBM材料,CP组和CDP组给予PEMF(4h/d,频率15Hz,场强5Gs)照射。
　　 5.在第1、3、7、10、14天时用MTT法分析细胞的增殖活性;在第1、7、14、21天时采用ELISA方法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性、放免法检测骨钙素(osteocalcin,OC)浓度。
　　 6.在第21天时,进行钙结节茜素红染色,然后在Olympus显微镜(IX71型,日本)下进行组织学观察,并统计钙结节数量。
　　 结果:
　　 1.制作的DBM颜色淡黄,质地较软。扫描电镜下可见DBM孔隙表面较光滑,孔隙大小为115.4μm-188.4μm,平均孔径为140.85±21.75μm。能谱仪检测DBM钙含量为11.49±0.84％。
　　 2.分离的原代hMSCs呈圆形,24h后可见细胞贴壁,呈梭形生长;当hMSCs生长达80％融合后,呈同向性生长,旋涡状排列,细胞细长而有突起。hMSCs的表面抗原CD44、CD105免疫组化染色阳性,细胞膜呈棕褐色。
　　 3.根据MTT检测结果,CD组、CP组和CDP组生长曲线较C组前移,CDP组较C组、CD组、CP组有更高的增殖峰值(p＜0.01);在第7、10、14天时,CDP组较C组、CD组、CP组升高(P＜0.01),在第7、10天时,CD组较CP组升高(P＜0.01)。
　　 4.种植后1天,各组间ALP活性无明显差异。在种植7天后CD组、CP组、CDP组ALP活性均明显升高(p＜0.01),随即CP组开始持续下降,而14天时CD组和CDP组ALP活性才达到最高值。第7、14天时CDP组ALP活性均较CD组、CP组显著升高(p＜0.01),第14天时CD组ALP活性较CP组显著升高(p＜0.01)。在21天时CD组、CP组、CDP组组间ALP活性无显著性差异,但以上三组仍较C组显著升高(p＜0.011。
　　 5.除C组外,CD组、CP组和CDP组的OC值在种植7天后均持续显著增高(p＜0.01),其中CDP组增速最快,CD组和CP组OC值在前14天培养过程中均无显著性差异,第21天时CD组较CP组显著升高。CDP组OC值在7、14、21天时均较CD组、CP组显著升高(p＜0.01)。
　　 6.在21天时钙结节茜素红染色在40倍镜下观察,平均视野内形成的钙结节数目为C组0个,CD组13.50±1.93个,CP组9.88±1.55个,CDP组19.13±3.27,钙结节数量CDP组明显要多于另外三组(p＜0.01),CD组多于CP组(p＜0.01)。
　　 结论:
　　 1.DBM与PEMF联合刺激及DBM和PEMF单独刺激均加快hMSCs的增殖;DBM促hMSCs增殖能力强于PEMF;DBM与PEMF联合刺激hMSCs增殖较。DBM和PEMF单独刺激更强。
　　 2.DBM和PEMF单独刺激促进hMSCs成骨分化的时间过程基本一致,但DBM的促分化作用更强;DBM与PEMF联合对hMSCs的促分化作用较DBM和PEMF单独刺激不仅开始时间早,而且强度更大。
　　 3.在DBM和PEMF单独作用促进钙盐沉积的后期,DBM的作用更强;DBM与PEMF联合刺激促进hMSCs成骨分化钙盐沉积时,不仅强度大而且持续时间更长。
　　 4.PEMF对DBM诱导hMSCs增殖与成骨分化具有明显的协同效应,外源性的电磁场可以用于骨组织工程促进种子细胞的分化和成骨。

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文献综述 脱钙骨的制备及其活性影响因素的研究进展

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