淋巴管内皮细胞podoplanin表达的分子探针标记和体外MR成像研究

摘要

目的:
　　 通过对金磁微粒（GoldMag）物理化学及生物学特性的检测，研究GoldMag 应用于磁共振成像（magnetic resonance imaging, MRI）分子成像的可行性。以GoldMag为载体构建podoplanin靶向的分子探针（GoldMag-pod），探讨GoldMag-pod对淋巴管内皮细胞（lymphatic endotheliAlcell, LEC）的特异性标记作用，以期为GoldMag-pod 体内研究肿瘤淋巴管生成提供实验基础和理论依据。
　　 材料与方法:
　　 分子探针的制备及理化性能评价：（1）以GoldMag为载体，采用“一步法”合成分子探针（GoldMag-pod 或GoldMag-IgG），分子探针表面用牛血清白蛋白（bovine serumalbumin, BSA）封闭非特异性结合位点；（2）分光光度计测量各样品在280nm 处的吸光值，计算GoldMag的抗体偶联效率及抗体载药量；（3）透射电子显微镜观察和测量USPIO、GoldMag、GoldMag-pod和GoldMag-IgG 纳米微粒的形态和平均粒径；（4）
　　 Zeta 激光粒度分析仪测量以上4种纳米微粒的Z-平均粒径和Zeta 电位；（5）酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法测定抗体（IgG抗体及抗podoplanin抗体）与GoldMag 结合前后的免疫活性，评价GoldMag对抗体免疫活性的影响程度；（6）选择FSE T1WI、FSE T2WI和GRE T2*WI 成像序列，对系列浓度的USPIO、GoldMag、GoldMag-BSA纳米微粒进行MR 扫描，研究纳米微粒的MR信号特点。
　　 GoldMag-pod对LEC细胞的靶向标记及MR 体外成像：（1）对人真皮原代淋巴管内皮细胞和人脐静脉血管内皮细胞培养和传代；（2）以系列浓度的GoldMag-pod 体外标记LEC 行普鲁士蓝染色，研究GoldMag-pod和LEC的阳性结合率与标记物浓度的关系；（3）对培养的LEC和VEC细胞行免疫荧光染色和免疫细胞化学染色，观察GoldMag-pod对LEC的特异性标记情况；（4）噻唑蓝（MTT）法检测系列浓度的GoldMag对LEC细胞活性的影响；（5）透射电镜观察GoldMag-pod在LEC细胞内的代谢情况；
　　 （6）对系列浓度的GoldMag 孵育LEC溶液、GoldMag-pod 标记LEC溶液、GoldMag-pod溶液和GoldMag溶液进行GRE T2*WI 成像，观察各组溶液的MR信号改变情况。
　　 结果:分子探针的制备及理化性能评价：（1）GoldMag 凭借其表面胶体金的非共价偶联作用，能将抗podoplanin抗体及IgG抗体成功吸附在其表面；（2）GoldMag-pod的抗体偶联效率和抗体载药量分别为52.94％和1mg的GoldMag 偶联79.41μg的抗podoplanin抗体；GoldMag-IgG的抗体偶联效率和抗体载药量分别为58.74％和1mg的GoldMag 偶联88.11μg的IgG抗体；（3）USPIO、GoldMag、GoldMag-pod和GoldMag-IgG 纳米微粒均呈类圆形，其平均粒径分别为14.7±1.4，47.7±4.1，66.8±4.9和67.3±5.5 nm；（4）以上4种微粒的Z-平均粒径分别为17.4、49.9、70.2和72.5 nm；
　　 Zeta 电位分别为10.1±4.1，13.7±5.6，-17.5±4.0和-16.1±3.9 mV；（5）抗podoplanin抗体与GoldMag 结合后其免疫活性下降为原先的42.05％；IgG抗体免疫活性下降为原先的43.34％；（6）3种纳米微粒溶液的FSE T1WI信号强度改变不明显，FSE T2WI信号强度随纳米微粒铁浓度的增高而轻微降低，GRE T2*WI信号强度随纳米微粒铁浓度的增高而显著降低。
　　 GoldMag-pod对LEC细胞的靶向标记及MR 体外成像：（1）人真皮原代淋巴管内皮细胞和人脐静脉血管内皮细胞在体外培养环境中生长状态良好；（2）普鲁士蓝染色结果表明GoldMag-pod对LEC的阳性标记率随GoldMag-pod浓度的增高而增高；（3）
　　 免疫荧光染色和免疫细胞化学染色结果表明，GoldMag-pod能对LEC 特异性标记，但与抗podoplanin抗体相比，其免疫活性较弱；（4）MTT 法结果显示GoldMag对LEC细胞活性的影响很小；（5）透射电镜结果显示GoldMag-pod 被LEC 吞噬，存在于溶酶体内，细胞的形态功能没有明显改变；（6）系列浓度的GoldMag 孵育LEC、GoldMag-pod 标记LEC、GoldMag-pod和GoldMag溶液的GRE T2*WI信号强度，随各组溶液浓度的增加而逐渐降低，其降低程度各组间比较依次增强。
　　 结论:
　　 GoldMag是一种核壳结构的双功能复合微粒，“一步法”能将抗体（抗podoplanin抗体或IgG抗体）成功偶联于GoldMag表面。所制得分子探针的抗体偶联效率及抗体载药量均较高，并具有较高的抗体免疫活性，使其能够应用于后续的免疫学实验。由GoldMag 合成的纳米探针具有较小的粒径，有利于穿透血管基底膜，到达靶组织及靶细胞。本实验所制得的GoldMag-pod能与LEC 特异性结合，其对LEC的特异性标记阳性率随着GoldMag-pod浓度的增加而增高。并且，GoldMag的生物毒性较低，在一定浓度范围内不会对正常细胞的生长及增殖活性产生影响；GoldMag-pod靶向标记的LEC 其GRE T2*WI信号强度明显降低。以上实验结果表明GoldMag 适用于MR分子成像，并且GoldMag-pod能靶向标记LEC，该研究为MR 体内成像研究肿瘤淋巴管生成提供了一定的实验基础及理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写对照

声明

前 言

第一部分 Podoplanin 靶向分子探针的制备及性能检测

第二部分 淋巴管内皮细胞的GoldMag-pod标记及体外MR 成像

全文结论

致 谢

附 图

参考文献

文献综述 乳腺癌磁共振分子成像的研究进展

研究生期间发表的文章