人脐血基质细胞联合移植促进造血细胞归巢植入及支持造血重建的实验研究

摘要

造血微环境（hematopoietic inductive microenvironment，HIM）是支持和调节造血干/祖细胞（haemopoietic stem/progenitor cell，HSPC）生长发育的内环境，其结构和功能的完整统一是维系造血功能正常进行的重要环节。作为造血微环境的重要组成部分，基质细胞可能通过形成造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）生长的“龛”，分泌造血生长因子（hematopoietic growth factor，HGF）和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）等参与造血细胞的自我更新、增殖分化和归巢定位，在免疫调节方面也具有重要的作用。深入探讨基质细胞对骨髓造血功能的影响，从修复或重建骨髓微环境正常功能入手治疗造血功能损伤具有重要的理论价值和实际意义。
　　 基质细胞由间充质干细胞（mesenchymAlstem cell，MSC）分化而来，是一个包括成纤维细胞、内皮细胞、成骨细胞、脂肪细胞、巨噬细胞和网状细胞等成分复杂的异质细胞群。自1977年Dexter在体外培养出人骨髓基质细胞（human bone marrow stromalcells，hBMSCs）获得成功后，人们对hBMSCs 进行了深入的研究。经实验研究和临床实践证实，hBMSCs 体外培养扩增联合HSC 回输是重建造血功能的有效方法。但hBMSCs 来源受限，采集骨髓增加供者痛苦和风险，且细胞数量及增殖分化潜能随供者年龄增加而下降。自体移植中患者自身基质细胞存在异常，而异体移植亦有可能带来移植物抗宿主病（graft-versus-host disease，GVHD）等免疫相关问题，均限制了hBMSCs在临床上的广泛运用。
　　 人脐血来源丰富，取材方便，具有未成熟的干/祖细胞比例高且免疫原性较低等特点，在多种造血系统恶性疾病临床治疗中具有潜在的应用价值。本课题组长期从事人脐血源基质细胞（human umbilicAlcord blood-derived stromAlcells，hUCBDSCs）及脐血造血微环境的研究，前期研究通过特定的细胞因子使hUCBDSCs 得以有效扩增，扩增后的hUCBDSCs在细胞成分和免疫表型上与hBMSCs 相似，能够分泌表达多种细胞因子，具备造血基质细胞的基本特征。以hUCBDSCs为滋养层的培养体系能有效支持脐血CD34+细胞体外扩增，特别对于促巨核细胞集落形成单位（colony formingunit-megakaryocte，CFU-Mk）形成的作用明显优于hBMSCs，提示hUCBDSCs在促进巨核系增殖分化成熟方面可能具有重要的意义。深入探讨hUCBDSCs 移植在体内支持和调控造血、重建造血微环境的作用可为造血功能损伤修复治疗提供新的思路。基于上述分析，本课题首先建立两种不同来源基质细胞滋养层（hUCBDSCs和hBMSCs）培养体系，采用CCK-8 法和Transwell 法分别观察两种基质细胞对脐血单个核细胞（human umbilicAlcord mononuclear cells，hUCB-MNCs）增殖、粘附和迁移的影响，并采用RT-PCR 法检测hUCBDSCs对归巢相关分子mRNA的表达情况。在此基础上建立BABL/c小鼠造血微环境辐照损伤模型，采用hUCB-MNCs 单移植，或分别联合两种不同来源基质细胞共移植的方法，比较观察两种基质细胞促进造血细胞体内归巢与植入、重建造血微环境及支持造血重建的作用，为安全有效的临床移植治疗提供新的辅助措施和手段。
　　 方法：
　　 1.体外构建hUCBDSCs和hBMSCs两种不同来源基质细胞滋养层培养体系。采用CCK-8 法和Transwell 法分别检测两种基质细胞对hUCB-MNCs 体外增殖、粘附和迁移的影响；采用RT-PCR 法检测hUCBDSCs对归巢相关因子（SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn）mRNA的表达情况。
　　 2.以近交系BABL/c小鼠作为受体鼠，经60CO γ 射线致死剂量8.5 Gy 全身照射预处理后分别接受不同剂量hUCB-MNCs （2、4、6 或8×106/只）单移植，或联合hUCBDSCs （2×106/只）共移植，移植后第6周流式细胞仪检测小鼠骨髓人源CD45+细胞植入率。
　　 3.采用CM-DiI 荧光染料预染hUCB-MNCs，辐照后BABL/c小鼠分别接受hUCB-MNCs （2×106/只）单移植，或联合两种不同来源基质细胞（2×106/只）共移植。激光共聚焦显微镜追踪观察移植后荧光标记hUCB-MNCs在小鼠体内的迁移分布情况，比较各组造血细胞归巢率。
　　 4.辐照后小鼠分别接受hUCB-MNCs （2×106/只）单移植，或联合两种不同来源基质细胞（2×106/只）共移植。观察移植后各组小鼠存活情况，记录生存率；动态检测外周血血象恢复情况，骨髓组织病理切片观察骨髓病理变化；不同时相点计数各组小鼠骨髓成纤维细胞集落形成单位（CFU-F）、脾集落形成单位（CFU-S）、粒/巨噬细胞集落形成单位（CFU-GM）和巨核细胞集落形成单位（CFU-Mk）产率。
　　 结果：
　　 1.hUCBDSCs对脐血单个核细胞体外增殖、粘附和迁移能力的影响
　　 同hBMSCs 共培养组和hUCB-MNCs 单独培养组相比较，hUCB-MNCs在hUCBDSCs 共培养条件下增殖能力显著增强。两种基质细胞均能促进hUCB-MNCs的粘附，且共培养后hUCB-MNCs 迁移能力也显著（P<0.05）强于无基质细胞支持对照。hUCBDSCs 明显表达与造血细胞归巢植入密切相关的粘附分子、细胞因子及受体（SDF-1、CXCR-4、ICAM-1、VCAM-1、HCAM、PECAM-1、Fn）mRNA，揭示其对造血细胞在体内的归巢和植入具有重要作用。
　　 2.hUCBDSCs 联合移植促进造血细胞归巢和植入
　　 辐照后小鼠分别接受不同剂量hUCB-MNCs （2、4、6 或8×106/只）单移植，或联合hUCBDSCs （2×106/只）共移植。采用不同剂量的hUCB-MNCs 单移植后的植入率随hUCB-MNCs 输注量增加而增长。hUCBDSCs 联合移植能不同程度提高小鼠骨髓中人CD45+细胞植入比例，尤其当输注低剂量hUCB-MNCs （2×106/只）时，hUCBDSCs共移植较单移植的植入率提高最为显著。激光共聚焦显微镜下观察CM-DiI 标记的hUCB-MNCs在移植后2～3天主要归巢至骨髓和脾脏。移植后48小时，hUCBDSCs共移植组归巢率显著（P<0.05）高于hBMSCs 共移植组和单移植组，显示移植后早期hUCBDSCs能促进造血细胞向骨髓迁移归巢。
　　 3．hUCBDSCs 联合移植修复受损微环境，支持造血重建
　　 两种基质细胞共移植组在移植后均能促进小鼠存活，血象恢复较快，在移植后28天内恢复至照射前水平。其中，hUCBDSCs 共移植组 血小板受抑程度较轻，回升也较快，并于移植后21天恢复至照射前水平；h BMSCs 共移植组白细胞于移植后10天迅速回升，在此后恢复趋势高于hUCBDSCs 共移植组；共移植两组间血红蛋白变化趋势无显著性差异。hUCBDSCs 联合移植移植后促进骨髓组织恢复，重建受损微环境，提高CFUs （CFU-F，CFU-S，CFU-GM，CFU-Mk）产率，特别是CHU-Mk 数量较hBMSCs 联合移植增多，提示hUCBDSCs对于促巨核系增殖分化具有重要作用。
　　 结论：
　　 1.hUCBDSCs能促进脐血单个核细胞增殖、粘附和迁移，且促增殖能力较hBMSCs 强。人脐血源基质细胞显著表达一些归巢相关因子的mRNA。
　　 2.hUCBDSCs 联合移植能提高移植后小鼠造血植入率，特别当造血细胞输注为低剂量时，这种作用更加显著。
　　 3.hUCBDSCs 联合移植能促进造血细胞早期迁移归巢至骨髓和脾脏，提高归巢效率。
　　 4.hUCBDSCs 联合移植能提高小鼠存活，促进移植后造血重建并修复受损微环境。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：中英文缩写一览表

声明

前言

第一部分人脐血源基质细胞对脐血造血细胞体外增殖、粘附和迁移的影响

第二部分人脐血源基质细胞联合移植促进脐血造血细胞归巢植入的研究

第三部分人脐血源基质细胞联合移植修复受损微环境重建造血功能的研究

全文总结

致谢

参考文献

文献综述:间充质基质细胞在临床移植中的应用进展

攻读硕士学位期间发表的文章