慢性应激抑郁大鼠FGF2和VEGF表达以及相互作用

摘要

抑郁症是一种发生率高、易复发、危害大的精神障碍，以持续的情绪低落和认知功能障碍为主要临床特征。近年来随着发病率不断增高而引起人们广泛关注，但其发病机理复杂，至今尚未完全阐明[1]。
　　 研究发现，脑内神经营养因子(neurotrophic factor，NTFs)、神经可塑性改变等因素与抑郁症的发生和转归密切相关。这对揭示抑郁症发病机制并为其防治提供新思路和途径。神经营养因子是一类活性蛋白质，主要由神经元支配的靶组织或胶质细胞产生，能够促进中枢和外周神经分化、生长和存活并对中枢和外周神经系统均有营养作用。这些小分子蛋白质具有55%～65%相同的氨基酸序列，并在神经系统的发育和维持正常生理功能中起着重要作用。学者在2006年提出了“抑郁症的神经营养假说”(Neurotrophinhypothesis of depression)。该假说认为，神经营养因子有促进突触生长、维持神经元生存的作用，如果前额叶、海马等脑区缺少神经营养因子则相应脑功能会受到抑制最终导致抑郁；而抗抑郁药物则是通过增加脑中的神经营养因子含量、提高突触的可塑性和促进神经元的生存来发挥其治疗抑郁的效果。即神经营养因子表达水平下降参与了抑郁症的病理生理过程。
　　 在抑郁症的候选基因研究中，FGF2和VEGF与神经营养和再生、神经可塑性改变等现象存在关联，因此受到广泛的关注。FGF2是成纤维细胞生长因子家族中的一员，具有促进神经组织损伤修复、神经保护和神经营养作用。成人大脑中的FGF2可促进神经元生长，在神经发生的早期就起到了一定作用[2]。研究表明FGF2与抑郁症密切相关，主要有如下几方面的依据：(1)国外尸解研究表明：抑郁患者前额叶皮质和海马FGF2 mRNA表达总量降低(在CA1区、CA4区表达低于齿状回)，且海马FGF2神经元减少[3]。(2)抗抑郁药物研究：研究证实使用抗抑郁药物治疗后，前额叶的FGF2表达增加[4]。(3)动物实验研究：Perez等通过检测小鼠体内FGF2，发现FGF2水平的高低与小鼠抑郁程度直接相关，而环境强化可降低抑郁程度。以上研究综合显示FGF2可能参与了多种生理过程而影响抑郁症。
　　 VEGF又称为血管生成因子，可以有效地促进血管再生以及内皮细胞的增殖。国外学者研究表明：抑郁症患者急性发作期，VEGF的水平有所增加[5]。不仅如此，VEGF能够通过刺激血管再生，保护缺血和退变的神经元，引发成年大脑神经元的再生，从而影响抑郁。其依据主要有如下几方面：(1)基因多态性相关研究：2010年Viikki等对VEGF基因多态性与抗抑郁治疗之间的关联进行了研究，他们选取了119名被试采用电惊厥疗法、8名被试采用了五羟色胺重吸收抑制(serotonin selective reuptake inhibitors，SSRI)疗法。结果发现VEGF2578 C/A位点在两种疗法后表达均有改变。(2)抗抑郁药物研究：研究使用多种抗抑郁药物以评价其效果，发现在侧脑室注射VEGF增加大鼠海马齿状回神经发生的同时，能产生抗抑郁样行为；而注射VEGF受体拮抗剂SU5416可以抵消VEGF介导的海马细胞增殖反应及抗抑郁效果。(3)动物实验研究：VEGF可以刺激SGZ区的细胞增殖并在动物模型的行为评定中产生类似抗抑郁药的效果，阻断VEGF，这种效果则被抑制。上述研究表明，VEGF可能与抗抑郁作用有所关联。
　　 综上，FGF2和VEGF均与抑郁症存在一定关联，二者的生物学功能也有一定相通之处，那么二者是否能够共同介导抑郁？抑郁症的神经可塑性假说和神经营养假说认为，抑郁症发生和痊愈过程中海马等脑结构会出现显著的功能和形态变化。应激或抑郁症会导致海马、前额叶与杏仁核等边缘区神经元萎缩和细胞丢失，并且引起神经营养因子表达下降；使用抗抑郁药物会促进成年海马神经再生以及神经营养因子表达增加，相应的增加成年海马神经发生以及神经营养因子的表达能够产生抗抑郁作用。目前研究结果显示抑郁症患者脑结构和功能改变主要在前额叶皮质、海马、杏仁核等主要靶器官[6]，是应激性反应的主要调节中枢和神经可塑性的脑区[7]。综合分析抗抑郁机制，其关键可能在于是否能够诱导成年海马神经发生以及神经营养因子表达增加，类似于药物的抗抑郁治疗作用[8]。据此，理论上可以通过调控相应神经营养因子的表达来治疗抑郁，但是FGF2和VEGF都是大分子，其单独作用时很难通过血脑屏障直接影响神经发生。且FGF2和VEGF单独作用时只能对抑郁症的部分生理机制作出解释。VEGF具有增加血管生成而影响神经发生的作用，FGF2也可通过神经保护作用或增加血管生成作用来提高神经系统的功能。那么当二者联合作用时是否可能通过血管生成而达到增加神经再生的作用？虽然FGF2、VEGF的生物学作用不同，但是功能互补甚至重叠，可能共同调控下游的信号传导以及基因转录过程，在抗抑郁过程中发挥着重要作用。因此，本研究拟从分子及蛋白水平研究FGF2和VEGF在海马以及前额叶皮质层的表达，并且对二者的在海马中的相互作用加以探讨。
　　 方法：
　　 1.采用慢性不可预知应激法(chronic Unpredietable mild stress，CUMS)建立抑郁症大鼠模型，运用敞箱实验(Open-field behavior)，测量糖水消耗量和摄食量及体重增量三种指标检测模型是否成功建立。
　　 2.在模型成功建立的基础上，将大鼠分为抑郁组以及对照组。运用免疫印记法(western-blot，WB)、荧光实时定量PCR(qreal-time PCR)检测CUMS大鼠海马脑区和前额皮质层FGF2和VEGF表达。
　　 3.探讨FGF2和VEGF的相互作用：将64只大鼠随机分为以下8组：A空白对照组：对照组注射生理盐水；B抑郁对照组：抑郁组注射生理盐水；C SU5402空白组：空白组注射SU5402；D SU5416空白组：空白组注射SU5416；E SU5402抑郁组：抑郁组注射SU5402；F SU5416抑郁组：抑郁组注射SU5416；G SU5402+SU5416组：抑郁组注射SU5402+SU5416；H SU5416+SU5402组：抑郁组注射SU5416+SU5402。采用免疫组化法观测FGF2和VEGF的形态学改变，并采用液体消耗实验、敞箱实验和强迫游泳等方法观测动物行为学表现。
　　 结果：
　　 实验一结果：通过28天的慢性不可预见应激，并采用测量摄食量及体重增量，糖水消耗量实验以及敞箱实验三种方法对模型的有效性进行检测，对所得数据进行分析。结果发现与对照组相比，抑郁组体重增量(94.61±2.37 g)显著低于对照组(142.22±3.09 g)(P<0.05)，糖水消耗实验中，抑郁组大鼠蔗糖的消耗量(51.05±0.39 ml)显著低于对照组(73.98±0.37 ml)(P<0.05)，敞箱实验中，抑郁组大鼠的水平运动得分(10.80±0.94)、垂直运动得分(6.04±0.49)均显著低于对照组(P<0.05)。上述结果表明慢性应激抑郁大鼠模型已成功建立。
　　 实验二结果：western-blot实验结果表明抑郁组大鼠海马脑区和前额皮质层FGF2和VEGF蛋白表达与对照组相比均发生了显著下调(P<0.05)；real-time PCR实验结果表明抑郁组大鼠海马脑区和前额皮质层FGF2和VEGF mRNA的表达与对照组相比均发生了显著下调(P<0.05)，与western-blot实验结果较为一致。上述实验结果提示：FGF2和VEGF在慢性应激抑郁大鼠模型中发生下调，二者可能在抑郁症的发病机理中起到了一定作用。
　　 实验三结果：行为学实验结果：在注射SU5402以及SU516后，糖水消耗实验，敝箱实验以及强迫游泳实验中均出现显著的抑郁样行为(P<0.05)；生物学实验结果：免疫组化结果发现注射SU5402以及SU516后，各组大鼠的FGF2，VEGF阳性细胞表达发生不同程度的下降。上述结果提示：FGF2通过上调VEGF的表达，拮抗慢性应激引发的抑郁行为，共同介导抑郁。
　　 结论：
　　 1.成功建立了CUMS大鼠模型，经过21天的慢性轻度不可预见性应激，通过观察大鼠一般情况，以及敞箱实验，糖水消耗量和摄食量及体重增量三种评价指标检测证实：该模型不仅能够模拟人类抑郁症的诸多症状，而且操作简便，可重复。是较为理想的抑郁动物模型，为以后的实验打下基础。
　　 2.FGF2和VEGF在CUMS模型的海马以及前额叶皮质层均发生了显著下调。提示上述神经营养因子在抑郁症的发病机理中起到一定作用，其机制可能是二者通过参与神经可塑性以及血管生成等生理过程来影响抑郁症的发生以及发展。
　　 3.FGF2和VEGF在CUMS模型的海马存在着相互作用调节抑郁症的共同基础。FGF2能上调VEGF的表达，二者共同发挥抗抑郁的作用。其机制可能是二者均为血小板相关生长因子，可以共同促进血管的形成，并且在丰富的脉管区或者其周围促进神经发生。其信号传导机制可能是通过共同调控下游的信号传导受体激活酪氨酸激酶通路发挥作用的。

目录

文摘

英文文摘

中英文对照表

前 言

1.问题提出与文献回顾

1.1 问题提出

1.2 文献回顾

1.3 以往研究的不足

1.4 研究假设与研究思路

2.实验一 慢性应激抑郁大鼠模型的建立与评价

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

3.实验二 CUMS大鼠海马脑区和前额皮质层FGF2和VEGF的表达

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

4.实验三CUMS大鼠海马脑区PGF2和VEGF相互作用研究

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨 论

5.全文讨论

5.1 创新点

5.2 研究不足

全文总结

致谢

参考文献

文献综述 VEGF调控抑郁症海马神经发生的机制述评

参考文献

附 录

研究生期间发表的文章