CD147/EMMPRIN与转移性骨肿瘤中破骨细胞活化机制的相关研究

摘要

研究背景和目的：
　　 骨组织是肿瘤晚期常见的转移部位，诸多恶性肿瘤晚期均易发生骨转移，其发生率要明显高于骨原发恶性肿瘤，其原发灶多来自前列腺癌、乳腺癌及肺癌等恶性肿瘤的晚期。肿瘤骨转移后多以溶骨性骨破坏为主，为患者带来骨质疏松、病理性骨折、进行性骨痛、高钙血症、脊髓压迫综合征等并发症，显著降低患者的5年生存率，严重影响患者的健康及生活质量。
　　 肿瘤骨转移是由肿瘤-骨微环境中，一系列细胞因子所参与的恶性循环过程，包括肿瘤细胞、骨细胞及基质之间的相互作用，从而导致肿瘤生长及骨质破坏。破骨细胞(osteoclasts，OCs)作为骨破坏吸收的关键细胞，肿瘤细胞可通过多种途径及多种因素来促进其形成及异常活化来介导溶骨性骨破坏的发生，因此OCs作为研究及防治肿瘤骨破坏的关键点，我们将予以深入研究。
　　 CD147又名细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteaseinducer，EMMPRIN)与多种肿瘤的侵袭、转移及预后密切相关。近年研究发现CD147能够诱导单核/巨噬细胞活化，并通过调节基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的产生，参与类风湿关节炎关节软骨、骨组织的降解破坏过程及牙周炎牙槽骨破坏过程。在乳腺癌的研究中发现当抑制CD147在乳腺癌细胞的过表达时，乳腺癌骨转移及骨破坏进程均得到有效延缓。因此我们相信在肿瘤骨转移及骨破坏过程中，可能有CD147直接或间接的参与，且经本实验组前期体外细胞研究发现CD147可高表达于OCs表面，并参与OCs的生成及活性调节。鉴于CD147发挥多种生物学活性均与其介导MMPs的产生密切相关，而MMPs又是OC活化过程中一种重要的调节因子，由此我们推测在肿瘤转移后的溶骨性破坏过程中存在着肿瘤细胞通过CD147激活OCs介导骨破坏的发生，其调节机制可能与MMPs的产生相关。
　　 因此本研究通过体外建立外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)向OCs分化成熟的模型，研究CD147与OCs分化过程中MMPs合成、分泌及活性调节的相关性，探讨CD147对OCs活化调节的机制和方式；通过检测转移性骨肿瘤。
　　 临床标本中CD147的表达情况，及CD147与肿瘤骨破坏过程中OCs活化的关系，初步验证前期体外实验的结论，从而完善对CD147参与肿瘤骨破坏过程的认识，并为本课题组的下一步深入研究提供相关实验参考和理论依据。
　　 方法：
　　 1.Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，贴壁法纯化所分离的外周血单个核细胞；
　　 2.引入外源性巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)蛋白和细胞核因子κB受体活化因子配基(receptor or activator ofNF-KB ligand，RANKL)蛋白诱导PBMCs向OCs分化，利用TRAP染色和骨吸收实验观察及鉴定诱导生成的细胞，并检测其骨吸收功能；
　　 3.实验分别分为第一部分两组[对照组(正常诱导组)和蛋白组]和第二部分两组[对照组(正常诱导组)和抗体组]；
　　 4.对诱导培养第12天的细胞，进行形态学观察及抗酒石酸的酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色鉴定，对与细胞共培养第30天的骨薄片，进行甲苯胺蓝染色，观察骨薄片表面骨吸收陷窝情况；
　　 5.Real-time PCR检测24h与48h时相点上OCs诱导分化过程中CD147 mRNA、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)mRNA及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)mRNA的表达情况，及分析三者的相关性；
　　 6.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测24h与48h时相点上OCs诱导分化过程中MMP-2、MMP-9酶蛋白的表达情况；
　　 7.明胶酶谱法检测OCs在24h与48h分泌的MMP-2、MMP-9酶蛋白活性变化情况；
　　 8.免疫组化SP法检测转移性骨肿瘤中CD147、MMP-2、MMP-9蛋白的表达情况；
　　 9.RT-PCR检测转移性骨肿瘤中CD147 mRNA、MMP-2 mRNA及MMP-9 mRNA的表达情况；
　　 10.苏木素-伊红(hematoxylin and eosin，HE)染色及TRAP染色观察及鉴定转移性骨肿瘤标本中OCs的情况；
　　 11.免疫组化SP法初步检测CD147在转移性骨肿瘤标本中OCs内的表达情况；
　　 12.采用SPSS17.0统计学软件进行数据分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
　　 结果：
　　 1.采用Ficoll密度梯度离心法，分离外周静脉血获得单个核细胞，并通过延长贴壁时间纯化细胞的方法，可以获得数量较多、纯度较好的单个核细胞，能够满足体外细胞实验需求；
　　 2.引入外源性RANKL蛋白和M-CSF蛋白能够诱导外周血单个核细胞生成TRAP染色阳性的单核或多核细胞，并具有骨吸收能力；
　　 3.TRAP染色结果示：蛋白组第12天TRAP(+)细胞数及体积显著高于对照组，且生成体积巨大的多核破骨细胞；抗体组第12天TRAP(+)细胞数及体积显著低于对照组，且未见多核破骨细胞形成。骨吸收实验结果示：蛋白组及对照组均形成明显的骨吸收陷凹；蛋白组形成大片状骨吸收陷窝，面积显著大于对照组；抗体组却未见骨吸收陷凹形成；
　　 4.Real-time PCR结果显示：24、48 h时相点上蛋白组细胞CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)；24h、48 h时相点上抗体组细胞CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA相对表达量均显著低于对照组(P<0.05)；两次实验中MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达量与CD147 mRNA的相对表达量均呈正相关关系[(R=0.818和R=0.758，P<0.05)，(R=0.525和R=0.552，P<0.05)]；
　　 5.ELISA检测结果显示：在24h与48 h时相点上蛋白组细胞MMP-2及MMP-9酶蛋白的分泌量均显著高于相应的对照组(P<0.05)；
　　 6.明胶酶谱法检测结果显示(酶蛋白活性以条带酶解量代表)：抗体组MMP-2、MMP-9酶原及活性酶条带的酶解量与对照组间比较具有显著差异(P<0.05)，且在24h、48h时相点上抗体组MMP-2、MMP-9酶原及活性酶条带的酶解量均显著低于相应的对照组(P<0.05)；
　　 7.免疫组化SP法检测转移性骨肿瘤中CD147、MMP-2及MMP-9蛋白的表达情况，结果示：CD147、MMP-2、MMP-9蛋白在转移性骨肿瘤中高表达，且显著高于良性骨肿瘤中的表达(P<0.05)；
　　 8.RT-PCR检测转移性骨肿瘤中CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA的表达情况，结果示：转移性骨肿瘤中CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA的相对表达量均显著高于良性骨肿瘤(P<0.05)，且MMP-2、MMP-9 mRNA的相对表达量与CD147 mRNA的相对表达量均成正相关关系(R=0.795和R=0.956，P<0.05)；
　　 9.HE染色及TRAP染色观察及鉴定转移性骨肿瘤标本中OCs的形态，结果示：转移性骨肿瘤组织标本中可见到多个多核巨细胞，分布于肿瘤组织与骨组织交界面的位置，经TRAP染色鉴定该多核巨细胞为TRAP染色阳性的破骨细胞；
　　 10.免疫组化SP法初步检测CD147在转移性骨肿瘤标本中OCs内的表达情况，结果示：CD147在转移性骨肿瘤标本内的破骨细胞胞浆及胞膜中，均呈现棕黄色的阳性反应。
　　 结论：
　　 1.使用外源性M-CSF蛋白及RANKL蛋白共同诱导外周血单个核细胞向破骨细胞分化的方法，能够诱导生成TRAP染色阳性，具有骨吸收能力的破骨细胞，此模型建立方法较为可靠，可以满足体外细胞实验的要求；
　　 2.外源性CD147蛋白增强破骨前体细胞CD147、MMP-2及MMP-9基因水平的表达，且能够促进体外OCs分化过程中MMP-2、MMP-9蛋白的分泌，提示外源性CD147可能与破骨细胞分化过程中基质金属蛋白酶的合成及分泌相关；
　　 3.CD147单克隆抗体(CD147 monoclonal antibodies，CD147mAb)能降低破骨前体细胞CD147、MMP-2及MMP-9基因水平的表达，且能够降低体外OCs分化过程中MMP-2、MMP-9酶蛋白的活性，提示内源性CD147可能与破骨细胞分化过程中基质金属蛋白酶的表达及活性调节相关；
　　 4.CD147、MMP-2及MMP-9在转移性骨肿瘤中高表达，且CD147与MMP-2、MMP-9的表达均呈正相关关系，提示三者可能与肿瘤骨转移及骨破坏过程密切相关；
　　 5.CD147在转移性骨肿瘤中破骨细胞内高表达，初步提示CD147可能与转移性骨肿瘤骨破坏过程中OCs的活化存在相关性。

目录

文摘

英文文摘

英文缩写一览表

前 言

第一部分 CD147/EMMPRIN与体外破骨细胞分化过程中基质金属蛋白酶合成、分泌及活性的相关研究

引言

分题一 破骨细胞体外诱导培养模型的建立及鉴定

材料和方法

结 果

分题二 外源性CD147与体外破骨细胞分化成熟过程中基质金属蛋白酶合成及分泌的相关性研究

材料和方法

结 果

分题三 内源性CD147在破骨细胞分化过程中基质金属蛋白酶表达及活性发挥中的作用研究

材料和方法

结 果

讨 论

第二部分 CD147/EMMPRIN在转移性骨肿瘤中的表达及其与破骨细胞活化的关系

引言

材料与方法

结 果

讨 论

全文结论

致谢

参考文献

文献综述 CD147/EMMPRIN与恶性肿瘤发生发展关系的研究进展

参考文献

研究生期间主要发表论文