Ascl12的RNA干扰通过microRNA-302b相关的途径抑制结肠癌前体细胞生长

摘要

研究背景及目的：
　　 结肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，预后不良，死亡率较高。结肠癌的治疗一直是一大难题，结肠癌早期诊断率低，而中晚期结肠癌侵袭和转移又使结肠癌的治疗面临着巨大的挑战。肿瘤干细胞理论的提出给结肠癌的治疗带来了新的希望。该理论认为肿瘤干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的种子细胞，在整个肿瘤细胞中仅占少数，但由于其具有无限增殖和不对称分裂能力，是恶性肿瘤不断生长、侵袭、转移和复发的根源。肿瘤干细胞是整个肿瘤的种子和源泉，是肿瘤得以发生、发展、转移和复发的“起始细胞”或“动力细胞”，在整个肿瘤过程中起着至关重要的作用。目前研究认为，结肠癌干细胞可能起源于正常成体肠隐窝干细胞。Asc12是一个碱性/螺旋-环-螺旋转录因子，研究已证实其控制正常成体肠隐窝干细胞“命运”。Asc12在小鼠肠上皮中的转基因过表达诱导了肠隐窝的过度增生和肠绒毛上的异位隐窝出现；Asc12基因在成体小鼠肠道的诱导缺失则导致Lgr5阳性的成体肠隐窝干细胞在数天后消失。并且，近来研究发现，Asc12在人结肠癌标本中表达上调。因此，我们设想，Asc12可能与结肠癌干/前体细胞相关。尽管如此，Asc12在结肠癌干/前体细胞中的作用尚未知。因此，我们选择了人结肠癌HT-29细胞(CD133阳性比例为47.5-95%)和LS174T细胞(CD133阳性比例为0.45%)来对Asc12在结肠癌干/前体细胞中的作用进行研究。
　　 研究方法及结果：
　　 免疫组织化学检测证实Asc12在结肠腺癌中表达增高，而在正常结肠组织中表达仅限于隐窝基底。Asc12干扰后，HT-29和LS174T细胞的体外增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力均下降，同时干扰后的细胞裸鼠皮下成瘤能力也降低。Western-blot和细胞免疫荧光检测发现CD133阳性HT-29细胞中Asc12蛋白质表达明显高于CD133阴性HT-29细胞。流式细胞仪检测进一步发现Asc12干扰后，HT-29细胞中CD133阳性细胞比例由54.7%下降到26.2%。与干细胞“干性”相关的基因CD133、Sox2、Oct4、Lgr5、Bmil和C-myc在Asc12干扰后HT-29和LS174T细胞出现mRNA和蛋白质表达水平下调(LS174T细胞由于流式检测CD133阳性细胞比例极低未检测CD133表达情况)，在两株细胞的裸鼠移植瘤中检测这些“干性”相关基因也得到一致的结果。同时，Asc12干扰后HT-29细胞的成球能力也下降，表现为所形成的肿瘤球大小和数目均减少。miRNA芯片筛选出26种miRNA在Asc12干扰后HT-29细胞中出现2倍以上的表达上调，而58种miRNA在Asc12干扰后HT-29细胞中出现2倍以上的表达下调。与干细胞“干性”相关的let-7b、miRNA-124、miRNA-125b、miRNA-17、miRNA-20a和miRNA-302b也包括在其中，并且行qPCR验证进一步证实了其表达差异。我们对这些miRNA进行进一步研究发现，用miRNA-302b mimics在Asc12干扰后的HT-29细胞中恢复了miRNA-302b的表达后，该细胞的成球能力得到恢复，并且部分“干性”相关基因表达出现上调，同时细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力均增强。
　　 结论：
　　 Asc12的RNA干扰可以导致结肠癌细胞生长抑制。Asc12是一个与结肠癌干/前体细胞“干性”密切相关的重要转录因子，并且可通过miRNA-302b相关的途径发挥其对结肠癌干/前体细胞“干性”的调控作用。Asc12可能作为一个针对结肠癌干/前体细胞的潜在靶标用于结肠癌的治疗。

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材料与方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

致谢

文献综述 Asc12在结肠癌干细胞“干性”维持中的作用

参考文献

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