一氧化氮抑制甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549细胞凋亡的实验研究

摘要

背景与目的:
　　新生儿呼吸窘迫综合征(neonatalrespiratorydistresssyndrome,NRDS)又称肺透明膜病(hyalinemembranedisease,HMD),是由肺表面活性物质(pulmonarysurfactant,PS)缺乏而导致,以新生儿出生后不久便出现呼吸窘迫呈进行性加重的综合征为主要临床表现,发病率及病死率高,易发于早产儿,胎龄愈小,发病率愈高,是新生儿重症监护室常见的危急重症。大量临床病例表明,患有妊娠期肝内胆汁淤积症(intrahepaticcholestasisofpregnancy,ICP)孕妇所产下的新生儿NRDS发病率较正常新生儿高出1倍以上,胆酸(Cholicacid,CA)极有可能是致病关键损伤因子。但对于ICP与NRDS的关系,临床报道较多,但发病机制仍未明确,ICP致NRDS发病的机制有待研究。
　　肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolartype2epithelium,ACEⅡ)是分泌合成PS的主要场所,AECII的凋亡将直接导致PS的分泌不足,从而使肺泡塌陷、萎缩,导致NRDS。胎儿AECII在增殖和分化的过程中长时间在羊水中浸润,设想胆酸诱导AECII凋亡可能是新生儿发生NRDS的原因之一。胆酸是胆汁酸中含量最为丰富的一种,前期研究发现胆酸对A549细胞株的凋亡产生了明显的诱导作用。甘氨鹅脱氧胆酸在肝脏和体内循环滞留可加重原发致病因素对肝脏的损害,其机制尚未完全阐明。设想甘氨鹅脱氧胆酸对AECII凋亡坏死也存在一定作用,并且可显著减少AECII中PS的合成。
　　近年来一氧化氮(nitricoxide,NO)在儿科学的应用中越来越广泛,在许多疾病的治疗中都取得良好效果,如新生儿肺动脉高压、早产儿支气管肺发育不良、先天性心脏病等。NO是一种可溶性气体,其作用机制依靠L-精氨酸在一氧化氮合酶催化下产生。在病理状态下,诱导型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)是NO大量生成的关键酶,具有重要意义。临床中研究发现,对严重呼吸衰竭的新生儿使用NO吸入治疗,显著降低了外源性PS和高频机械通气的使用率。机械通气初期开始使用NO吸入治疗效果明显好于呼吸衰竭严重时再使用的效果。上述临床治疗效果强烈提示一氧化氮具备降低肺动脉高压之外的其他治疗作用,项目组前期研究发现NRDS中AECⅡ的凋亡对呼吸衰竭具有重要影响。
　　方法:
　　第一部分:用胰蛋白酶消化法培养肺泡Ⅱ型上皮细胞,大鼠IgG包被细胞培养瓶提纯,碱性磷酸酶(AKP)染色法鉴定。
　　第二部分:大鼠孕晚期颈后皮下注射苯甲酸雌二醇建立ICP大鼠模型。
　　第三部分:本实验研究使用人肺癌上皮细胞株A549,采用免疫荧光实验方法证明甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549依赖caspase-3途径凋亡。采用蛋白印迹法(WesternBlot)方法检测iNOS表达水平。通过在甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549细胞凋亡的模型中检测GCDC的浓度对一氧化氮合酶的表达程度的变化,以及使用流式细胞仪检测外源性NO对GCDC诱导A549细胞凋亡的抑制作用。
　　结果:
　　1.0.25％胰蛋白酶消化分离肺组织,含10%小牛血清高糖培养基可以满足细胞体培养。
　　2.孕晚期第15天最佳注射浓度为2.5mg/kg体重的苯甲酸雌二醇,连续注射5天,可复制出ICP的动物模型。
　　3.GCDC处理后A549细胞依赖caspase-3途径凋亡;GCDC可抑制iNOS在细胞中的水平表达,并且GCDC浓度与抑制iNOS表达程度正相关;以NO供体SNAP0.2mmol单独处理A549时,细胞不发生凋亡;SNAP和GCDC共同处理A549后可明显降低细胞的凋亡程度。
　　结论:
　　1.0.25%胰蛋白酶消化分离肺组织,含10%小牛血清高糖培养基可以满足细胞体培养,并研究肺泡Ⅱ型上皮细胞功能的需要。
　　2.孕鼠在孕晚期第15天注射浓度为2.5mg/kg体重的苯甲酸雌二醇,可复制出ICP的动物模型。
　　3.胆酸可诱导A549细胞凋亡,同时证明甘氨鹅脱氧胆酸可诱导A549细胞依赖经典capease-3途径凋亡,并且NO可抑制由甘氨鹅脱氧胆酸诱导的A549细胞的凋亡。

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缩略语表

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第一章 前 言

第二章 SD大鼠胎鼠肺泡II型上皮细胞的分离、纯化与鉴定

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3 结果

2.4 讨

2.5 小结

第三章 SD大鼠妊娠期肝内胆汁淤积症动物模型的复制

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结

第四章 一氧化氮抑制甘氨鹅脱氧胆酸诱导A549细胞凋亡的实验研究

4.1 前

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结

全文结论

参考文献

文献综述妊娠期肝内胆汁淤积综合症导致的新生儿呼吸窘迫综合征研究进展

参考文献

攻读硕士研究生期间发表论文

致谢