SDF-1α/CXCR4轴对心肌干细胞迁移及归巢修复心肌的影响

摘要

背景与目的:
　　心肌梗死(myocardiuminfarction,MI)是由于冠状动脉狭窄、闭塞导致心肌坏死后引起的一种严重危害人类健康的疾病,其最终结果往往会导致心力衰竭,目前药物治疗、内科介入治疗、外科冠状动脉旁路搭桥术仅仅只能恢复局部心肌组织的血液供应,并不能从根本上修复已经发生坏死的心肌组织。以往的观念认为心脏是一个终末分化器官,当发生损伤时,心肌不能再生,仅能通过心肌肥大来进行代偿。但是,近年来的研究表明,在成年个体心脏内存在有一群原始的心肌干细胞(cardiacstemcells,CSCs),可以分化为心肌、平滑肌、内皮细胞,参与损伤修复,CSCs移植可以减少梗死面积,CSCs的发现为心肌损伤修复提供了新策略。研究表明,CSCs主要存在于心尖、心房等干细胞巢内,在心肌发生损伤时,CSCs如何动员及向损伤区域归巢的机制尚不清楚。
　　基质细胞衍生因子-1α(Stromalcell-derivedfactor,SDF-1α)属于CXC族趋化因子成员,是生物体内一种关键的细胞趋化因子。CXCR4(C-X-Cchemokinereceptortype4)是SDF-1α的受体,表达于多种干/祖细胞表面,可与SDF-1α耦合介导其迁移。我们及其他学者的研究发现心肌缺血、血管内膜损伤可上调SDF-1α的表达,介导多种干细胞归巢新生血管、修复损伤内皮。最近研究发现SDF-1α参与心梗后CSCs分化调控,可促进血管新生、减小心梗面积。但SDF-1α/CXCR4轴调控CSCs归巢的作用及机制有待进一步研究。
　　磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)蛋白家族是一种胞内磷脂酰肌醇激酶,广泛表达于多种组织与细胞中,参与细胞迁移、增殖、分化、凋亡、血管生成和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。多项实验表明,PI3K参与SDF-1α/CXCR4调控的骨髓基质干细胞、内皮祖细胞、造血干细胞等多种干/祖细胞趋化作用及迁移。VEGF基因转染可促进CSCs向心肌梗死区域归巢,但PI3K/Akt的抑制剂wortmannin可阻断这一效应,这一结果表明,PI3K在CSCs的迁移、归巢中发挥作用。我们前期的实验及文献报道表明,CSCs表面表达有CXCR4,CXCR4可通过激活PI3K途径促进其他干/祖细胞迁移、归巢,SDF-1α是否可以通过CXCR4/PI3K途径介导CSCs的迁移、归巢?
　　本课题观察SDF-1α/CXCR4轴对CSCs体外迁移的影响,同时探讨PI3K通路是否参与SDF-1α/CXCR4轴介导的CSCs迁移;采用心梗区注射SDF-1α基因联合梗死周边注射CSCs的方法,评价SDF-1α/CXCR4轴在CSCs归巢及心肌再生中的作用,并探讨PI3K通路在其中的作用。
　　方法:
　　1.构建rAAV1-SDF1α-eGFP载体。根据基因序列合成SDF-1αcDNA,插入pSNAV2.0-mCMV-EGFP的SalⅠ和BglⅡ位点,即合成pSNAV2.0-SDF1α-EGFP质粒。合成的质粒通过酶切、PCR和测序鉴定。采用脂质体转染法,pSNAV2.0-SDF1α-EGFP与辅助质粒pAAV-R2C1、pHelper三质粒共转染293细胞,产生rAAV1-SDF1α-eGFP。将构建的rAAV1-SDF1α-EGFP转染体外培养的心肌细胞,免疫荧光检测GFP及心肌细胞内SDF-1α表达情况,检测重组腺相关病毒转染效率。
　　2.心脏酶消化培养联合免疫磁珠分选(MACS)纯化c-kit心肌干细胞,并作克隆培养,免疫荧光检测分选细胞表面c-kit表达情况,流式细胞仪检测MACS分选前后的细胞表面标志物c-kit和CD45或Sca-1或CXCR4的表达情况。c-kit心肌干细胞在分化诱导液中培养21天后,免疫荧光检测心肌细胞标志物c-TnI、平滑肌细胞标志物α-SMA和内皮细胞标志物vWF表达情况。
　　3.采用Transwell模型检测SDF-1α对CSCs迁移的影响及其可能机制。下室种植心肌细胞,转染rAAV1-SDF1α-eGFP,上室为纯化的CSCs。实验共分为四组,对照组心肌细胞转染rAAV1-eGFP,SDF-1α、AMD3100和LY294002组心肌细胞转染rAAV1-SDF1α-eGFP;3天后CSCs加在上室中,AMD3100和LY294002组CSCs在迁移实验前分别与AMD3100(10μg/ml)和LY294002(20μmol/L)孵育1小时。24h后5个高倍视野计数迁移的细胞。ELISA检测上清SDF-1α的浓度。
　　4.左冠脉前降支(LAD)结扎建立小鼠心梗模型后,在梗死区注射rAAV1-SDF1α-eGFP,在梗死区边缘注射标记的CSCs,观察移植CSCs体内归巢及对心梗修复的影响。实验共分为6组:假手术组(sham组):开胸,不作其他处理;心梗组(MI组):结扎LAD制造心梗,但不作其它处理;空病毒对照组(empty组):结扎LAD,梗死区分5个点注射50μlrAAV1-eGFP空病毒,梗死周边区分5个点注射50μlDAPI标记的CSCs(含105细胞);SDF-1α组:结扎LAD,梗死区注射50μlrAAV1-SDF1α-eGFP病毒(1×1011vg),梗死周边区注射CSCs;AMD3100组和LY294002组:同SDF-1α组,CSCs注入梗死周边区前分别用AMD3100(10μg/ml)和LY294002(20μM)孵育1小时。21天后,颈脱臼处死小鼠,共聚焦荧光显微镜下检测梗死周边进行干细胞注射的empty组、SDF-1α组、AMD3100组和LY294002组DAPI标记的CSCs向梗死区迁移的情况,梗死区每个心脏标本随机取10个高倍视野,计数迁移到梗死区的DAPI标记的细胞数量。WB检测心梗区SDF-1α表达,各组WB条带的OD值与sham组的OD值的比值作为各组的SDF-1α强度。
　　5.对心梗修复的影响采用TTC(triphenyltetrazoliumchloride,2,3,5—氯化三苯基四氮唑)染色法检测进行LAD结扎的empty组、MI组、SDF-1α组、AMD3100组和LY294002组的心肌梗死范围。TTC染色后刀片分离梗死区与非梗死区,计算梗死区重量和心脏总重量的百分比作为梗死区的范围。
　　6.归巢到梗死区的CSCs分化情况采用免疫荧光检测。检测从周边迁移到梗死区的DAPI标记的CSCs体内是否表达心肌特异性标志物c-TnI,每个心脏标本,梗死区随机取10个高倍视野,计算DAPI、c-TnI双阳性与DAPI阳性细胞的比例,作为CSCs向梗死区迁移后向心肌系分化的百分比。
　　7.检测CSCs体内增殖情况。CSCs体外用BrdU标记后注入体内,腺相关病毒注射及CSCs移植方法同上。本实验分4组:Empty组、SDF-1α组、AMD3100组和LY294002组。21天后处死小鼠,免疫荧光检测BrdU,DAPI染核。每个心脏标本梗死区随机取10个高倍视野,BrdU阳性细胞与DAPI阳性细胞的比例可以间接反应迁移到梗死区的CSCs体内增殖情况。
　　结果:
　　1.pSNAV2.0-SDF1α-EGFP质粒,经PCR、酶切可扩增一约270bp的条带,与SDF-1αcDNA长度一致,基因测序与目的基因序列完全一致,说明质粒合成正确。重组腺相关病毒rAAV1-SDF1α-eGFP转染心肌细胞后免疫荧光可检测到GFP和SDF-1α表达,构建成功。
　　2.酶消化联合MACS可得到纯度较高的c-kitCSCs,免疫荧光检测,膜表面c-kit为阳性,在体外可克隆扩增。流式结果表明,MACS分选前,混合细胞中c-kit阳性细胞比例为8.31±0.35％,经c-kit免疫磁珠纯化后为97±4.51%,c-kit/CXCR4双阳性细胞比例分别为2.58±1.16%、4.54±1.79%和91.04±2.65%。这些CSCs基本都表达CXCR4。经分化诱导培养21天后,可表达c-TnI、α-SMA和vWF,说明c-kit心肌干细胞具有多向分化潜能。
　　3.Transwell迁移实验表明,rAAV1-SDF1α-eGFP转染心肌细胞,可提高上清中2.CSCs成功体外培养、分离、扩增,表达CXCR4,诱导分化后可表达心肌细胞、平滑肌细胞、内皮细胞特异性标志。
　　3.心肌细胞体外转染rAAV1-SDF1α-eGFP促进CSCs迁移,AMD3100和LY294002可阻断此效应。
　　4.SDF-1α过表达可促进移植的CSCs向梗死区募集,分化为心肌细胞,减少梗死面积,AMD3100和LY294002可阻断此效应。PI3K信号通路参与SDF-1α介导的CSCs迁移。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 腺相关病毒rAAV1-SDF1α-EGFP载体构建及鉴定

2.1 材料与方法

2.2 结

2.3 讨论

2.4 结论

第三章 CSCs体外培养、分离及鉴定

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 结论

第四章 SDF-1α/CXCR4调控心肌干细胞迁移、归巢及可能机制的研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 结论

全文总结

参考文献

文献综述心肌干细胞研究进展

参考文献

博士就读期间发表论文情况

致谢