复层电纺膜用于硬脑膜替代材料的研究

摘要

研究背景及目的：
　　由外伤、炎症、肿瘤侵蚀粘连、手术切除或先天畸形等情况引起硬脑(脊)膜缺损在临床上很常见,这种缺损或愈合不良可以引起很多并发症,如脑脊液渗漏、颅内感染、脑膜炎和癫痫等,是神经外科手术中经常需要解决的一个问题。
　　传统的硬脑膜替代材料中,自体组织、同种异体组织、异种组织存在取材不便或潜在病毒感染风险等缺点,近年来已较少应用,曾经使用的人工惰性材料不能体内降解,长期存留易产生慢性炎症和排异反应。目前临床广泛应用的硬脑膜替代材料是异体异种组织中单独提取的活性胶原蛋白,经重组和无害化处理制成薄膜材料称为胶原基质,它不会造成炎症反应或异物反应,可以促进创面组织修复和硬脑膜新生并可以自然降解,在临床应用中总体的效果比较满意。但是胶原基质自身力学强度差,为脑组织提供的保护有限,硬脑膜下腔封闭不佳等缺点使术后增加了脑脊液漏的风险,限制了其广泛的应用。近年来人工合成可降解聚合物具备了优良的力学性能和体内可降解特性,成为组织工程材料研究的热门,但其不足是自身缺乏生物活性对创面愈合及自身硬脑膜的新生没有明显的促进作用。
　　静电纺丝能够简单快速的生成纳米纤维,已成为有效制备纳米纤维材料的主要途径之一。电纺材料具有良好的超微构造,能构建类细胞外基质(ECM)结构,其相互连通的孔隙有利于细胞长入,有高度的表面体积比,扩大了与细胞的接触面积,因此静电纺丝技术广泛应用于组织工程领域。
　　本研究的目的是模仿天然硬脑膜的构造,使用静电纺丝技术制作复层结构硬脑膜替代材料,结合活性胶原与人工合成可降解材料各自的优点,在整体保留良好力学性能同时,通过分层结构让材料的内表面减少与脑组织的粘连,中间层起到加固和防水作用,外层含有胶原成分发挥生物活性并促进组织再生。提出复层电纺膜作为硬脑膜替代材料的研究意义和应用前景。
　　研究方法：
　　1.电纺膜的制备:静电纺丝制作不同配比的胶原、PCL和PLA电纺膜材料,根据力学性能,柔软度和电纺稳定性确定各层电纺膜成分构成,优化电纺参数并制作完整的复层电纺膜修补材料。
　　2.电纺膜的表征及特性:扫描电子显微镜下观察电纺膜的微观形态,测量纤维直径及孔径。测量力学性能、吸水率、孔隙率、防水性、体外降解率等,并与胶原基质进行对比测试。
　　3.电纺膜的细胞相容性及内外层结构对体外培养成纤维细胞功能的影响:分别在内外层材料上培养HSF细胞,观察电纺膜表面的细胞生长情况,吖啶橙染色MTT检测材料的细胞相容性;粘附实验、定量PCR和Westernblot等方法,对比内外层上生长的成纤维细胞粘附性和分泌细胞外基质等主要功能,了解内外层材料对细胞活性的影响。
　　4.电纺膜动物体内植入实验:SD大鼠皮下植入电纺膜以验证生物相容性,HE染色,扫描电镜观察电纺膜表面和内部的细胞生长情况。构建新西兰兔硬脑膜缺损动物模型,电纺膜作为硬脑膜替代材料植入实验,验证材料的动物体内植入效果,HE染色观察电纺膜内部细胞生长情况,植入部位脑组织HE染色观察材料植入的实际效果和影响。
　　实验结果：
　　1.通过电纺参数优化和电纺膜力学性能测试确定了复层电纺膜的构成。PLA为内层材料;PLA/PCL(1/1)电纺膜在实验分组中拥有最大的抗拉强度,并且断裂伸长与柔软度较好,用于中层材料制作;6％wt胶原/PLA(4/1)电纺溶液组在保证胶原含量最大化的前提下能够得到稳定良好的电纺纤维,用于外层材料的制作。通过连续的分层电纺技术制作复层电纺膜,通过电纺时间控制材料的厚度,内层电纺时间2h、中层4h、外层6h,静电纺丝完成后整个电纺膜厚度约为150~300μm。
　　2.电纺膜与胶原基质在力学性能、孔隙率、吸水率、防水性上进行对比测试,电纺膜各项性能有显著提高。
　　3.HSF细胞能够在电纺膜内外层材料上生长并正常增值,吖啶橙染色与MTT检测显示在材料外层上生长的细胞增值性优于内层和培养板对照;粘附实验显示外层材料有利于HSF细胞粘附;定量PCR和Westernblot的结果显示在外层材料上生长的HSF细胞在分泌细胞外基质功能上优于内层和培养板对照。
　　4.大鼠皮下植入电纺膜后组织细胞能够在材料内外层上贴附并生长,HE染色显示外层材料较内层材料中有更多成纤维细胞和表皮样细胞迁移生长入内部。构建新西兰兔硬脑膜缺损动物模型,植入复层电纺膜替代材料术后动物恢复良好,未出现切口感染和颅内感染征象。电纺膜材料取出时内表面与脑组织无明显粘连,材料外层则与周围组织紧密贴合,剥离时有一定阻力;移植部位及周边的脑组织表面颜色正常、无明显损伤、水肿、炎性反应。电纺膜HE染色可见材料外层较内层有更多成纤维和表皮样细胞长入其中;植入部位脑组织HE染色显示电纺膜与自身筋膜对照组没有明显差异,均未出现明显炎症反应及肉芽组织增生的痕迹。
　　结论：
　　本课题运用静电纺丝技术制作了具有良好超微结构的复层硬脑膜替代材料,其结构模仿了天然硬脑膜,成分为内层PLA、中层50%PLA50%PCL、外层80%胶原20%PLA,三层的厚度比例约为1:2:3,总体厚度约为150~300μm。电纺膜与临床常用的胶原基质材料对比在力学性能、吸水率、孔隙率、防水性上有明显提高。通过在电纺膜上培养HSF细胞验证了电纺膜有良好的细胞相容性,证实了材料外层含有的活性胶原成分有利于增强成纤维细胞的粘附及分泌等功能,通过大鼠皮下植入和新西兰兔硬脑膜缺损植入实验验证了电纺膜的组织相容性,证实了材料内层与周围组织没有产生明显粘连,胶原外层有促进细胞生长的作用。这种新型复层电纺膜作为硬脑膜替代材料具有科学研究的意义和应用前景。

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缩略语表

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摘要

第一章 前言

1.1 选题缘由

1.2 研究背景

1.3 研究意义

1.4 研究内容

1.5 研究方法

第二章 复层结构电纺膜的制备

2.1 材料、仪器设备与方法

2.2 结 果

2.3 讨 论

第三章 复层电纺膜的表征及特性

3.1 材料、仪器设备与方法

3.2 结 果

3.3 讨 论

第四章 复层电纺膜的细胞相容性及内外层结构对体外培养成纤维细胞功能的影响

4.1 材料、仪器设备与方法

4.2 结 果

4.3 讨 论

第五章 复层电纺膜动物体内植入实验

5.1 材料、仪器设备与方法

5.2 结 果

5.3 讨 论

全文结论

参考文献

文献综述静电纺丝的生物医学应用

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文

致谢