VPAC1特异性结合多肽配体筛选与鉴定的研究

摘要

研究背景和目的:
　　肿瘤细胞常高水平表达某些特定的表面分子如肿瘤相关抗原或特异性受体等,而这类分子在正常组织细胞则低表达或不表达,使其成为重要的肿瘤分子影像诊断和治疗靶标。VPAC1作为血管活性肠肽受体其中一种亚型,在多种肿瘤细胞表面高水平表达,而低表达或不表达于正常组织细胞,并在肿瘤的进展和血管生成中发挥重要作用,是一具潜在应用价值的分子影像诊断和治疗靶标。目前,常规诊断肿瘤的影像学方法主要以解剖结构改变为基础,缺乏足够的特异性和准确性。核医学受体显像属于分子影像范畴,它是利用放射性核素标记受体的配体作为显像探针,探测体内受体分布、密度和亲和力等改变,具有敏感性高、特异性强和准确性好等优点。因此,寻找肿瘤细胞特异性受体的小分子配体,制备新型的受体分子显像探针,实现对肿瘤早期诊断和个体化治疗具有重要的理论意义和应用价值。噬菌体肽库展示作为一种分子筛选技术,可用于筛选针对几乎任何靶标的小分子多肽,在肿瘤的分子影像探针、生物治疗制剂研发以及药物载体研究中发挥重要作用。
　　本研究拟通过构建稳定表达VPAC1的CHO-K1细胞,利用噬菌体十二肽库进行全细胞差减筛选获得能特异高亲和结合VPAC1的十二肽,为发展以VPAC1受体为靶点的肿瘤分子影像诊断和治疗研究奠定基础。
　　研究方法:
　　1.真核表达载体pcDNA3.1(+)-VPAC1的构建:通过设计特异性引物化学合成VPAC1的编码基因,克隆至载体pcDNA3.1(+),通过双酶切、PCR及测序鉴定。
　　2.稳定表达VPAC1的CHO-K1细胞株的建立:将真核表达载体pcDNA3.1(+)-VPAC1通过脂质体转染CHO-K1细胞,经过G418抗性筛选获得抗性细胞株,并运用RT-PCR、Westernblot和免疫荧光证实目的基因VPAC1的表达。
　　3.噬菌体十二肽库的全细胞差减筛选:以稳定表达VPAC1的CHO-K1/VPAC1细胞为靶细胞,CHO-K1细胞作为非特异性吸附细胞对噬菌体十二肽库进行差减筛选,经过四轮筛选后,随机挑取60个克隆,测序并进行序列同源分析,以细胞ELISA法鉴定挑选克隆与CHO-K1/VPAC1细胞结合特异性,排除假阳性和非特异性结合克隆,确定候选阳性克隆作进一步鉴定。
　　4.目标多肽的鉴定:挑选候选目克隆,合成外源插入的十二肽,通过竞争结合实验证实候选克隆与CHO-K1/VPAC1细胞的结合是通过其插入外源多肽介导;受体结合分析验证目标多肽与VPAC1受体结合特异性;免疫荧光和流式细胞分析鉴定目标多肽与高表达VPAC1的结直肠癌细胞结合特性。
　　研究结果:
　　1.成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VPAC1,经过酶切和PCR鉴定能得到特异性条带,通用引物测序证实序列正确。
　　2.真核表达载体pcDNA3.1(+)-VPAC1转染CHO-K1细胞,经过G418筛选抗性稳定株,经RT-PCR、Westernblot和免疫荧光鉴定,稳定株细胞在mRNA和蛋白水平均有VPAC1表达。
　　3.经过四轮差减筛选,噬菌体在靶细胞中得到明显富集,回收率从第一轮2.978×10-6增加到第四轮1.538×10-3,增加了约516.5倍,而吸附细胞所结合的噬菌体则保持低水平并有所下降;随机挑取60个克隆测序,最终得到18条不同的多肽序列,发现VP2克隆重复最多达16次;ELISA结果显示,VP1、VP2、VP5、VP6、VP8、VP10、VP16克隆与CHO-K1-VPAC1细胞和CHO-K1细胞结合的OD值有明显差异,可以认为这部分克隆在两种细胞间有差异性结合,其中VP2克隆结合差异性最大,因此挑选VP2克隆做进一步鉴定。
　　4.竞争结合ELISA结果显示,VP2克隆与CHO-K1-VPAC1细胞结合能被其所插入的外源VP2多肽竞争抑制,表明VP2克隆与CHO-K1-VPAC1细胞结合通过其插入的VP2多肽介导;竞争抑制ELISA结果和流式细胞分析显示,当加入血管活性肠肽受体的天然配体VIP后,可显著抑制VP2噬菌体克隆或VP2多肽与CHO-K1-VPAC1细胞的结合,表明VP2多肽和VIP共同竞争结合VPAC1受体,即VP2多肽能够特异结合VPAC1;免疫荧光和流式细胞分析结果显示,FITC-VP2多肽能够特异性结合CHO-K1-VPAC1细胞及高表达VPAC1的结直肠癌细胞。
　　研究结论:
　　1.本研究成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-VPAC1和筛选得到稳定表达VPAC1的CHO-K1细胞。
　　2.VP2克隆序列重复次数最多,在CHO-K1-VPAC1细胞和CHO-K1细胞间结合差异性最强,成功挑选到阳性候选克隆。
　　3.VP2多肽能够特异性高亲和结合VPAC1受体和结直肠癌细胞,是一具有潜在应用价值的肿瘤分子显像探针。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 稳定表达VPAC1的CHO-K1细胞系建立

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.1.3 实验结果

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 实验结果

第三章 VPAC1特异性结合肽的噬菌体十二肽库筛选

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.3 实验结果

3.4 讨论

第四章 VPAC1特异性结合VP2多肽的鉴定

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.3 实验结果

4.4 讨论

全文结论

参考文献

文献综述(一)噬菌体肽库展示在肿瘤分子影像诊断中的应用进展

参考文献

文献综述(二)血管活性肠肽受体显像及治疗研究进展

参考文献

攻读学位期间发表论文及获奖情况

致谢