骨髓间充质干细胞-脱细胞膀胱基质-聚丙烯复合网片的实验研究

摘要

盆腔器官脱垂(pelvic floor prolapse,POP)是中老年妇女的常见病疾之一,中重度POP可以严重影响女性生活质量并造成巨大的心理负担,临床上亟需有效的治疗方法。盆底重建手术是治疗中重度 POP最重要的手术方式。传统POP修复术式主要是在已经受损或有异常胶原生成的薄弱盆底组织(筋膜、结缔组织及韧带)上进行手术修补,无法从根本上解决组织缺陷的疾病本质,术后复发率高,因此临床上亟需更为安全稳定的修补材料(作为盆底薄弱组织的有效替代)来改进手术方式,从而提高POP手术治疗的效果。
　　近年来,生物组织工程技术发展十分迅速,生物工程组织替代材料作为薄弱或受损盆底的支持物可更好的用于盆底正常解剖结构的重建,达到恢复盆底正常支持功能的目的。聚丙烯网片(polypropylene mesh,PM)作为一种合成网片在盆底重建手术中应用较为广泛,但易发生感染、挛缩、排异、慢性疼痛、性交困难等不良反应,严重影响患者术后的生活质量。细胞外基质(extracellular matrix,ECM)具有良好的组织相容性,在植入体内后可发挥免疫调节的作用,促进Th1细胞(免疫排斥)向Th2细胞(免疫耐受)及M1型巨噬细胞(促炎症和细胞毒性)向M2型巨噬细胞(抗炎和组织修复)的转变。猪脱细胞后的膀胱基质(urinary bladder matrix,UBM)属于ECM的一种,来源便捷,生产成本较低,是目前生物材料研究范畴的热点之一,其缺点是植入体内后降解较快。来源于骨髓的间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)属于多能干细胞的一种,来源丰富且具有多向分化潜能,是组织工程常用的种子细胞之一。BMSCs作为一种修复干细胞,在一定的生物微环境中可分化为具有与周围组织相似的功能细胞,参与到受损部位的组织修复。同时,BMSCs在体内外表现出显著的抗炎症和免疫抑制的作用。本研究采用联合物理与化学的方法制备猪脱细胞UBM,并采用全骨髓贴壁法分离、培养大鼠BMSCs,利用组织工程学的原理将培养的BMSCs接种于UBM-PM支架上,构建了BMSCs-UBM-PM复合网片。同时,观察BMSCs-UBM-PM植入大鼠腹部皮下后引起的组织病理学变化、炎症反应、免疫耐受情况,并行力学性能检测,探讨其用作盆底修复和重建候选替代材料的可行性。
　　一、实验方法
　　1、猪脱细胞UBM的制备
　　本研究对猪膀胱采用去污剂洗涤、搅拌、酶消化法进行脱细胞处理,制备UBM。扫描电镜观察冻干UBM形态。取UBM标本常规石蜡切片后行HE及DAPI染色观察脱细胞效果,碱水解法测定UBM标本中羟脯氨酸的含量,分子生物学方法测定UBM标本中的DNA浓度。
　　2、大鼠BMSCs的分离、鉴定其在UBM上的生长及增殖研究
　　采用全骨髓贴壁法分离、培养大鼠 BMSCs,腺病毒(携带有 GFP基因片段)感染SD大鼠BMSCs。流式细胞仪检测细胞表面分子CD29、 CD44、CD31、CD45,成脂、成骨、成软骨诱导试剂盒检测BMSCs向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞分化。CCK-8细胞增殖实验、扫描电镜观察BMSCs在UBM上的生长、增殖情况。
　　3、骨髓间充质干细胞-脱细胞膀胱基质-聚丙烯复合网片在大鼠体内的实验研究
　　SD大鼠随机分为4组,每组20只,根据预植入材料的不同,分别命名为BMSCs-UBM-PM组(PM夹于负载有BMSCs的双层UBM之间)、UBM-PM组(PM夹于未负载BMSCs的双层UBM之间)、PM组(单纯PM)和假手术(sham-operated,S)组。手术后第1、2、4、6周分批处死大鼠,取材行HE染色、Masson染色、免疫组化染色、免疫荧光染色和力学测试。
　　二、实验结果
　　1.经脱细胞处理后的膀胱未见明显的细胞成分残留,可见均质状态的基质和呈网络样结构改变胶原纤维。冻干后的 UBM干燥、质地坚韧,抗张力强度高,延展性下降。扫描电镜下可见胶原纤维排列整齐、均匀,纹理较粗,呈条索状改变。脱细胞前UBM中的平均羟脯氨酸含量为2.45μg/mg,脱细胞后UBM中的平均羟脯氨酸含量为2.34μg/mg,差异无统计学意义(P>0.05)。UBM中的平均DNA浓度由脱细胞前的443.71μg/ml降为脱细胞后的4.32μg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。
　　2.全骨髓贴壁法分离、培养 SD大鼠 BMSCs,24h观察发现细胞部分贴壁,48h观察发现贴壁细胞分裂增殖,呈梭形或多边形,细胞传代3次形态上无较大改变。BMSCs表达CD29的阳性率为98.74％、CD44的阳性率为95.43%、CD31的阳性率为2.03%、CD45的阳性率为1.14%。成脂、成骨、成软骨诱导BMSCs后油红 O、茜素红及阿利新蓝染色均呈阳性,腺病毒(携带有GFP基因片段)能成功感染BMSCs。CCK-8细胞增殖实验提示BMSCs在UBM上生长良好,增殖能力较强。扫描电镜下见BMSCs在UBM上呈梭形或多边形生长。
　　3.BMSCs-UBM-PM组炎症细胞浸润少且胶原纤维、新生血管较多。免疫荧光示BMSCs可在体内至少存活6周,部分可分化为平滑肌细胞。免疫组化结果提示BMSCs-UBM-PM在各周的CXCR3(Th1细胞表面标志)阳性比例均低于其他各组,而PM在各周的CXCR3阳性比例均高于其他各组。UBM-PM的CXCR3阳性比例介于两者之间。BMSCs-UBM-PM和UBM-PM的CCR4(Th2细胞表面标志)阳性比例在第2周达到最高,而PM的CCR4阳性比例在各周均处于较低水平。力学测试显示, BMSCs-UBM-PM组最大负荷(kN)为0.31±0.08,最大张力(mm/mm)为0.62±0.19,杨氏模数(MPa)为43.36±11.83,均显著高于其他组测试结果。
　　三、主要结论
　　1.联合物理与化学的方法进行脱细胞处理,制备的 UBM有良好的组织相容性,胶原蛋白丢失较少,消毒、冻干后易于储存,是一种较为理想的组织工程、盆底修复和替代用生物支架材料。
　　2.全骨髓贴壁法分离、培养所得的 SD大鼠 BMSCs纯度高,活性好,体外扩增能力强,可作为组织工程用的种子细胞。
　　3. BMSCs-UBM-聚丙烯复合网片与传统的聚丙烯补片相比,植入大鼠体内后引起的炎症反应弱,可诱导移植耐受,有良好的生物相容性和较强的组织张力,因此该复合网片可作为修复和重建盆底组织理想的候选替代材料。

目录

封面

声明

目录

缩略语表

英文摘要

中文摘要

第一章 前言

第二章 猪脱细胞膀胱基质的制备

2.1 材料与方法

2.2 实验结果

2.3 讨论

第三章 大鼠骨髓间充质干细胞的分离、鉴定及在脱细胞膀胱基质上的生长及增殖研究

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

第四章 骨髓间充质干细胞-脱细胞膀胱基质-聚丙烯复合网片在大鼠体内的实验研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述

参考文献

在读硕士期间学术成果

致谢