神经元IRAK1/4及脑缺血预适应后小胶质细胞活化的作用机制研究

摘要

缺血性脑卒中是世界上常见的致死致残原因,其继发的脑缺血缺氧性损伤是一个涉及多种机制、多个阶段、多种神经细胞相互作用的过程,主要包括兴奋性氨基酸毒性、炎症反应及细胞凋亡这三个方面,各种机制在脑缺血缺氧的各个时期分别或协同发挥作用。其中,损伤效应持续数小时~数周的炎症机制成为缺血性脑卒中治疗的合理切入点。在缺血缺氧性损伤导致的炎症病理过程中,神经元和小胶质细胞均被证明在缺血性脑卒中启动的炎症反应中发挥重要作用。其中,神经元是神经功能损害的直接原因,而小胶质细胞是脑内常驻的巨噬细胞,是脑内炎症反应主要的发动者和参与者。既往研究认为缺血性脑卒中引发的小胶质细胞过度活化是导致神经元继发性损伤的重要原因。最新研究证实,神经元内自身炎症信号通路激活在急性脑缺血缺氧性损伤早期发挥重要作用,且此作用的发挥并不依赖于梗塞区域皮层小胶质细胞活化,小胶质细胞在脑缺血过程中活化滞后,主要在继发性脑损伤中发挥作用。针对上述两种神经细胞在缺血性脑卒中诱导的急性缺血缺氧性脑损伤中不同的活化时效特点,本课题紧紧围绕缺血性脑卒中后急性缺血缺氧性脑损伤早期脑保护这个关键科学问题,分别从神经元及小胶质细胞角度,系统提出了两种干预及保护机制:
　　1.神经元IRAK-1/4抑制:Toll样受体(Toll Like Receptors, TLRs)是体内重要的模式识别受体(Pattern Recognition Receptor, PRR),在多种感染性疾病及神经退行性病变发展过程中发挥了重要作用。近年来, TLR-2/4已被证实在脑内广泛表达,神经元TLR-2/4基因敲除可显著减轻急性脑缺血缺氧引起的神经功能缺陷、缩小梗塞灶体积。白介素-1受体相关激酶-1/4(Interleukin-1 Receptor-Associated Kinases,IRAKs)是 TLRs通路下游关键的调控因子。目前,已有多方面证据提示 IRAK-1/4对TLRs通路调控具有关键作用:首先,IRAK1被IRAK4磷酸化是TLRs通路髓样分化因子88(Myeloid Differentiation factor88, MyD88)依赖途径最早的活化环节,与早期受体复合物的形成和下游信号分子的激活关系密切。其次,IRAK4基因敲除小鼠TLRs通路下游细胞因子严重缺失,IRAK4基因缺失/突变的患者对外源性 MyD88依赖的TLRs配体反应严重减低。但目前对于TLRs在缺血性脑损伤研究尚局限于 TLRs本身及通路下游炎性细胞因子,而对处于 TLRs通路关键调控地位的 IRAKs研究还停留在外周细胞水平,IRAK-1/4在脑内缺血引起的炎症启动及信号转递中的调控作用尚无相关报道。据此,本课题提出通过抑制脑缺血后神经元 IRAK-1/4活化,可以调控神经元TLR-2/4受体下游炎症因子释放,抑制过度炎症反应,从而发挥神经保护作用的假设。
　　2.小胶质细胞预活化:脑缺血预适应(Cerebral Ischemic Preconditioning, CIP)是指短暂的脑缺血(预处理)可减轻随后严重、长时间脑缺血导致的脑损伤,已被证实可在缺血性脑卒中发挥明确的保护作用。因此,揭示脑缺血预适应的神经保护机制并予以利用,对缺血性脑卒中防治研究具有重大意义。但是,脑缺血预适应的神经保护机制非常复杂,目前仍未阐明,尤其是脑内免疫功能的主要执行者――小胶质细胞在此过程中发挥怎样的作用目前尚缺乏研究。现已证实小胶质细胞在脑缺血过程中活化滞后,并未直接参加缺血性脑卒中后急性缺血缺氧导致的早期炎症反应。我们的前期工作及相关研究发现脑缺血预适应可使小胶质细胞活化过程提前,且其活化部位与脑缺血预适应的神经保护区域显著相关。据此,本课题提出通过脑缺血预适应调控小胶质细胞活化发挥神经保护作用的假设。
　　一、神经元IRAK1/4抑制在大鼠缺血性脑损伤早期中的作用及机制研究
　　目的
　　明确脑缺血/缺氧早期神经元IRAK-1/4表达变化与神经损伤的关系,探讨神经元IRAK-1/4抑制在脑缺血/缺氧性损伤中的作用及机制。
　　方法
　　整个研究包括在体和离体实验。
　　1.颈内动脉线栓法建立SD大鼠大脑中动脉梗塞(Middle Cerebral Artery Occlusion, MCAO)模型;
　　2.将实验动物随机分成正常对照组(Control group)、假手术组(Sham surgery group)、缺血组(Vehicle group)和干预组(Treatment group);
　　3.应用免疫荧光、RT-PCR、Western blot方法测定各组缺血性脑卒中后3、6、12、24 h脑内神经元 IRAK-1/4表达变化;
　　4.测定各组7 d生存率、神经功能评分、梗塞体积,评价IRAK-1/4 inhibitor对缺血性脑卒中早期脑损伤作用;
　　5.建立二氯化钴(Cobalt Chloride, CoCl2)诱导的 B35神经元样细胞化学性缺氧损伤模型;
　　6.应用免疫荧光、RT-PCR、Western blot方法测定各组化学缺氧1、3、6、12、24 h后B35细胞内IRAK-1/4表达变化;
　　7. CCK8、免疫荧光、流式细胞法检评价IRAK-1/4 inhibitor对B35化学缺氧损伤的作用;
　　8.免疫荧光、ELISA、Western blot法检测各组IRAK-1/4 inhibitor对B35细胞TLRs信号通路分子影响:(1)NF-κB p65亚基核转位(2)TNF-α、IL-6分泌变化(3)T-JNK、p-JNK及c-Casepase3表达变化。
　　结果
　　在体实验
　　1.脑皮层神经元表达 IRAK-1和-4,其表达变化参与MCAO诱导的大鼠神经元急性缺血缺氧性损伤病理过程。
　　2.神经元 IRAK-1/4抑制可减轻 MCAO诱导的大鼠神经元急性缺血缺氧性损害,包括缩小梗塞体积,减轻神经功能损害,提高生存率。
　　离体实验
　　1. B35表达 IRAK-1和-4,其表达变化参与CoCl2诱导的B35化学缺氧性损伤病理过程。
　　2. IRAK-1/4抑制可减轻CoCl2诱导的B35细胞毒性损伤。
　　3. IRAK-1/4抑制可减轻CoCl2诱导的B35凋亡损伤。
　　4. IRAK-1/4抑制的神经保护作用机制可能与抑制 B35 TLRs通路下游 NF-κB p65亚基核转位,减少炎症因子 TNF-α、IL-6分泌有关。
　　5. IRAK-1/4抑制的神经保护作用机制可能与抑制B35 TLRs通路下游JNK磷酸化,并减少 c-Caspase3产生有关。
　　结论
　　神经元IRAK-1和-4参与缺血性脑卒中后急性缺血/缺氧脑损伤病理过程,神经元IRAK-1/4抑制能够发挥神经保护作用,其作用机制与抑制神经元自身TLRs信号通路下游 NF-κB p65亚基核转位及 JNK磷酸化,并最终降低促炎因子 TNF-α、IL-6及促凋亡c-caspase3产生有关。因此,IRAK-1/4抑制可能是减轻缺血性脑卒中诱导的急性缺血缺氧性损伤的新的重要策略。
　　二、小胶质细胞活化参与脑缺血预适应神经保护的作用及机制研究
　　目的
　　研究脑缺血预适应调控的小胶质细胞活化特点及其与脑缺血预适应神经保护作用的关系,并从小胶质细胞免疫分型 M1/M2变化角度探讨脑缺血预适应调控小胶质细胞发挥神经保护作用的机制。
　　方法
　　整个研究包括在体和离体实验。
　　1.应用颈内动脉线栓法建立 SD大鼠 MCAO/短暂性 MCAO(transient middle cerebral artery occlusion, tMCAO)模拟的缺血性脑卒中/CIP模型;
　　2.将实验动物随机分成正常对照组(Control group)、假手术组(Sham surgery group)、缺血组(Vehicle group)、预适应组(Preconditioning group)和干预组(Treatment group);
　　3.测定各组3 d生存率、神经功能评分、梗塞体积,评价CIP及CIP联合米诺环素对缺血性脑卒中早期脑损伤作用;
　　4.应用免疫荧光测定各组 MCAO后1、12、24 h缺血皮层小胶质细胞数量及活化情况;
　　5.使用RT-PCR方法检测各组 MCAO后12 h缺血皮层M1(CD16、CD32、iNOS)/M2(TGF-beta、Ym1/2)mRNA表达情况;
　　6.应用原位杂交检测脑缺血预适应对大鼠缺血区域周边皮层炎症细胞因子表达影响;
　　7.建立氧糖剥离(Oxygen Glucose Deprivation, OGD)/短暂性氧糖剥离(transient Oxygen Glucose Deprivation, tOGD)诱导的缺血/缺血预适应模型;
　　8. CCK8、LDH法检评价tOGD及tOGD联合米诺环素对PC12+BV2共培养OGD24 h损伤的作用;
　　9.应用免疫荧光检测各组 MCAO后12 h缺血皮层及 OGD后2 h小胶质细胞CD11b表达情况;
　　10. Realtime-PCR等方法测定各组OGD后1、6、12、24 h后BV2细胞内M1(CD32、iNOS、CD86)/M2(CD206、IL-10、CCL-22)表达变化。
　　结果
　　在体实验
　　1. tMCAO可减轻MCAO诱导的大鼠急性缺血缺氧性脑损害,包括缩小梗塞体积,减轻神经功能损害,提高生存率;使用米诺环素对 tMCAO调控小胶质细胞活化过程进行抑制,能显著降低tMCAO神经保护作用。
　　2. tMCAO可调控MCAO诱导的局灶性脑缺血皮层小胶质细胞数量增多,活化过程提前;
　　3. tMCAO抑制缺血皮层在MCAO12 h表达M1(CD11b)标记物,调控M1(CD32、iNOS、CD86)/M2(CD206、IL-10、CCL-22)mRNA表达;
　　4. tMCAO促使脑内IκB-α在MCAO早期升高,并始终维持TNF-α表达在较低水平有关。
　　体外实验
　　1. tOGD可减轻 PC12神经元样细胞 OGD损伤;
　　2. tOGD可抑制 BV2细胞在 OGD后2 h表达 M1(CD11b)标记物,调控M1(CD32、iNOS、CD86)/M2(CD206、IL-10、CCL-22)mRNA表达;
　　结论
　　CIP可调控MCAO诱导的局灶性脑缺血皮层小胶质细胞数量增多,活化过程提前,参与CIP神经保护作用,小胶质细胞免疫功能调控发挥保护作用,其作用机制可能与调控缺血性脑卒中早期小胶质细胞的 M1/M2极化状态,抑制 TLR-2/4炎症信号通路过度活化,促使脑内IκB-α早期升高,并始终维持TNF-α表达在较低水平有关。我们的研究提示,诱导或修饰小胶质细胞朝神经元保护方向分化为靶点的脑缺血预适应研究可能是减轻缺血性脑卒中后急性缺血缺氧性脑损伤研究的新思路。

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缩略语表

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中文摘要

第一章 前 言

1.1以神经元 IRAK-1/4 抑制为切入点的保护机制探讨

1.2 以脑缺血预适应调控小胶质细胞活化时间提前、免疫功能改变为切入点的保护机制探讨

第二章 大鼠缺血性脑损伤在体/体外模型的建立及评价

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

2.4 小结

第三章 神经元IRAK1/4抑制在大鼠缺血性脑损伤早期中的作用及机制研究

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

3.4 小结

第四章 小胶质细胞活化参与脑缺血预适应神经保护的作用及机制研究

4.1 材料与方法

4.2 结果

4.3 讨论

4.4 小结

全文总结

参考文献

文献综述

硕博连续期间发表的论文

致谢