基于同轴电纺技术的rFN/CDH仿生支架体外促MSC成骨分化的实验研究

摘要

由于创伤或先天性原因导致的不可恢复的骨组织损伤及结构改变，每年有大量的患者需要通过骨移植方式进行骨组织再生重建。当前，很多种方法被应用于骨组织修复重建，主要是通过使用自体骨移植（从患者），异体骨移植（从供体）和各种生物材料三种方式进行。自体骨移植一直以来被认为是治疗骨缺损的金标准，虽然有成功的案例，但这种技术受到材料可用性的限制。同种异体植骨技术，则可能会引入免疫排斥反应或病原体侵入等副作用。因此寻找可替代的人工骨修复材料成为骨组织修复重建的发展方向。
　　成功实现组织工程化骨损伤修复包含三个主要因素:具有成骨分化潜能的种子细胞、具有诱导种子细胞向成骨方向分化的生长因子以及支持种子细胞生长的三维立体支架。因此，本课题的目的在于利用同轴静电纺丝技术，构建能够缓慢释放促成骨诱导因子的纳米纤维复合支架。为种子细胞提供理想的体外增殖、粘附、分化微环境，促进体外组织工程化骨损伤修复。为组织工程化骨损伤修复的研究提供新的思路。
　　方法:
　　1.不同rFN/CDH11蛋白浓度的仿生纳米骨支架的制备
　　基于课题组的前期工作，课题组成员张瑗博士合成的rFN/CDH11蛋白的融合基因，利用pET22b作为基因载体，以Rosetta-gamiTM i(DE3)为感受态细胞，表达和纯化得到的rFN/CDH11蛋白质。采用同轴静电纺丝技术，构建含有聚乙烯醇(PVA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、Ⅰ型胶原蛋白，以及不同浓度的重组纤维连接蛋白/钙粘附蛋白(0μg/ml、1.0μg/ml、10.0μg/ml、50.0μg/ml、100.0μg/ml)的仿生纳米骨支架。
　　2.不同rFN/CDH11蛋白浓度的仿生纳米骨支架的表征评价
　　利用傅立叶红外光谱仪(FTIR)、X线光电子能谱(XPS)、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)以及高效液相色谱分析(HPLC)等方法，了解骨支架的化学元素的组成、表面微观结构，纳米纤维的微观结构以及rFN/CDH11蛋白的释放效率;接触角分析(Contact Angle)与生物力学分析法用于测定纳米骨支架的亲/疏水性与抗拉强度、弹性模量。通过评价仿生骨纳米支架的生物理化性质，判断能否与组织相容。
　　3.不同rFN/CDH11蛋白浓度的仿生纳米骨支架的体外功能学研究
　　以入骨髓间充质干细胞(hMSCs)为种子细胞，通过扫描电镜法观察hMSCs在骨支架表面增殖、粘附、形态的情况;MTT法检测细胞增殖与支架的对细胞的毒性作用;实时定量PCR(qRT-PCR)法检测ALPL基因、OCN基因、RUNX2基因的表达情况。
　　结果:
　　1.不同rFN/CDH11蛋白浓度的仿生纳米骨支架的制备
　　按照最适宜的同轴电纺参数条件（V=16-18Kv，v内=v外=0.4-0.7ml/h，d=15cm），成功制备不同rFN/CDH11蛋白浓度的仿生纳米骨支架若干张。
　　2.不同rFN/CDH11蛋白浓度的仿生纳米骨支架的表征评价
　　(1)SEM观察骨支架表面形态均匀，纳米纤维连续性较好，无串珠样纤维存在，直径分布均匀。Image J软件测量结果显示骨支架的纤维直径与加入的rFN/CDH11蛋白成反比。(2)TEM观察了单根同轴纳米纤维的内部微观结构，为具有相同轴心的壳-核结构。(3)XPS数据显示133.0 eV、164.0eV、190.0 eV以及401.0eV峰谱，即硫(S)、磷(P)、氮元素(N)，说明Ⅰ型胶原蛋白与rFN/CDH11蛋白已经被纺入同轴纤维内。(4)FTIR结果表明，同轴电纺过程中没有产生新的化学基团产生，同轴纤维具各材料的优势性能。(5)孔隙率测定表明骨支架中的孔隙率介于67-76％之间，其大小与rFN/CDH11蛋白浓度成正比。(6)接触角测试说明骨支架中含rFN/CDH11蛋白浓度越大，支架的亲水性越好。(7)力学测试结果显示骨支架的承受的抗拉强度及弹性模量与支架中的rFN/CDH11蛋白浓度成正比。(8)蛋白释放检测显示出蛋白质早期的“爆发性释放”及后续的缓释效果，实现了蛋白的可控缓慢释放。通过以上表征评价，50μg/ml及100μg/ml浓度的rFN/CDH11蛋白骨支架具有较好的理化性质。
　　3.不同rFN/CDH11蛋白浓度的仿生纳米骨支架的体外功能学研究
　　(1)SEM观察hMSCs在接种到支架上培养3天、7天后的细胞形态:3天组中50μg/ml蛋白浓度组的细胞生长状态最好，成嵌入式生长在支架表面，粘稠物质可能是分泌型成骨细胞分泌的细胞外基质。7天组，各个蛋白浓度组之间未见明显差异(2) MTT法检测支架的促细胞粘附作用:hMSCs细胞接种0.5h，1h，2h三个时间点内，50μg/ml蛋白浓度组的OD值均最大且明显高于阴性对照组(p＜0.05)。(3) MTT法检测骨支架促细胞增殖作用:hMSCs细胞接种2、4、6、8天四个时间点内，50μg/ml蛋白浓度组的OD值均最大且明显高于阴性对照组(p＜0.05)。(4)实时定量PCR法测试诱导成骨标志基因的结果显示:hMSCs细胞接种1、2、3周内，50μg/ml蛋白浓度组与阴性对照组的RQ值倍数均最大且明显高于阴性对照组(p＜0.05);1周时，RUNX2基因表达最高，ALPL基因次之;2周时，OCN基因及ALPL基因表达升高，RUNX2基因表达相对下降;3周时RUNX2基因表达再次升高。通过以上细胞学实验研究，50μg/ml蛋白浓度的rFN/CDH11蛋白骨支架具有最佳的促hMSCs粘附、增殖、分化的作用。
　　结论:
　　1.本课题组前期工作中发现rFN/CDH11融合蛋白具有良好的促hMSCs细胞粘附、增殖及向成骨细胞方向分化的能力，结合同轴静电纺丝特有的壳-核结构，较好的实现了rFN/CDH11蛋白的缓释作用，持续而缓慢的作用于种子细胞。
　　2.同轴静电纺丝法构建的含有rFN/CDH11蛋白的纳米纤维骨支架是由独特的壳-核结构，直径分布为400-800nm的纤维通过无序的排列形成，微观结构类似于细胞外基质的空间结构。
　　3.同轴静电纺丝法构建的含有rFN/CDH11蛋白的纳米纤维骨支架具有良好的亲水性、抗拉强度、化学组成以及优良的可降解性，是一种能与细胞相容的仿生骨组织工程支架。
　　4.不同rFN/CDH11蛋白浓度的同轴静电纺丝法构建的纳米纤维骨支架均促进了hMSCs体外增殖、粘附作用，hMSCs经成骨诱导分化后，成骨标志物基因如ALPL基因、OCN基因、RUNX2基因的表达上调。其中50μg/ml rFN/CDH11蛋白浓度的骨支架较其他4个浓度的纳米纤维骨支架而言，成骨标志基因表达显著上调。
　　5.50μg/ml rFN/CDH11蛋白浓度的同轴静电纺丝纳米纤维骨支架具有优良的骨诱导与传导性质，可作为未来应用与骨组织工程损伤修复的新型人工骨替代材料，但能否在体内发挥良好的成骨作用，仍需进一步研究。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章：构建含不同rFN／CDH11蛋白浓度的仿生骨纳米纤维支架

2．1 材料、仪器与试剂

2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 不同rFN／CDH11蛋白浓度的仿生骨纳米纤维支架的表征评价

3．1 材料、仪器与试剂

3．2 实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 不同rFN／CDH11蛋白浓度的仿生纳米纤维骨支架的体外功能评价

4．1 材料、仪器与试剂

4．2 实验方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

4．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述 静电纺丝技术在骨与软骨组织修复方面的研究进展

博士在读期间发表的论文

致谢