整合三维结构的h-CLAT皮肤致敏检测方法研究

摘要

研究背景：
　　皮肤组织是人体阻挡外界物质的重要屏障，为人体稳态提供重要保证。其中主要为角质形成细胞、成纤维细胞、朗格汉斯细胞和黑色素细胞等4种细胞。人体皮肤作为阻挡外界物质干扰的第一道关卡，会通过某些特殊反应进行防御。接触性过敏性皮炎，是一种由外源物质引发的IV型过敏反应，是化学品分类标识、化妆品和皮肤接触产品毒性评价的重要内容。接触性过敏性皮炎是皮肤致敏的直接临床表现，人群中有15-20％的皮肤致敏发生率，而引起这类反应的物质在生活环境中随处可见。因此对物质成分致敏能力的筛查就变得非常重要。
　　豚鼠实验（例如：豚鼠的最大剂量实验）是最为常用的筛查物质致敏性的动物实验，目前，优化后的小鼠局部淋巴结实验（LLNA），以一种早期的预测工具逐步应用在风险评估中。然而，随着新的欧洲的化妆品法规（第七次欧洲化妆品指令修订案）颁布关于动物实验在化妆产品中的禁令，某些地区化妆产品的皮肤致敏动物实验得到禁止。
　　如此情势下，许多非动物的皮肤致敏筛查实验逐步得到开发利用和法规认可。由于皮肤致敏机制的复杂性，同一个体外测试系统中很难全面反映整个致敏过程，所以，体外实验的开发需要考虑针对不同的反应层次进行描述（例如：化学物质的皮肤渗透、蛋白质/多肽结合、特异性抗原免疫反应的起始），如此才能够将体内致敏的过程以一种有害结局通路（AOP）的形式通过系列实验进行模拟。
　　皮肤致敏的诱导阶段，朗格汉斯细胞（LC）起着决定性的作用，通过呈递和修饰抗原承担着启动免疫反应的作用。在这个过程中，LC成熟表现为：II型组织相容性复合物（MHC）的上调、共刺激分子的表达上调（CD86、CD54、CD80和CD40），同时还有IL-18表达增加的现象。许多抗原特异性的免疫反应方法使用的是树突状细胞（DCs），其中包括LC。相关研究尝试使用这类原代细胞，但是由于捐献者的差异性问题，导致该细胞在体外实验系统中存在不稳定性。
　　为避免此类问题，通过一些DCs细胞系进行模拟该类细胞，例如：THP-1细胞、U937细胞（人组织细胞性淋巴瘤细胞系）、KG-1细胞（人骨髓性白血病细胞系）和MUTZ-3（人单核细胞系）。本研究基于THP-1细胞的皮肤致敏检测方法（h-CLAT），联合HaCaT角质细胞和EpiskinTM皮肤模型进行皮肤致敏筛查实验，通过THP-1细胞表面CD86/CD54的改变对物质的致敏情况进行判断。
　　研究目的：
　　构建体外培养的h-CLAT皮肤致敏检测系统，并分别结合HaCaT角质细胞和EpiskinTM皮肤模型，塑造不同的皮肤致敏整合测试方法。通过监测暴露受试物后的细胞活率、白介素18（IL-18）表达情况、细胞表面标志物CD54/CD86表达情况和相对荧光强度，建立基于h-CLAT的皮肤致敏实验整合测试体系，为化学品和个人护理产品的皮肤致敏特性提供预测和评估。
　　研究内容与方法：
　　第一部分、h-CLAT皮肤致敏检测方法的研究
　　1.细胞培养：
　　THP-1细胞：使用RPMI1640培养基，加入10%的胎牛血清（FBS），25mM4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），0.05mM巯基乙醇和1%青霉素-链霉素（双抗）。
　　2.物质筛查：
　　使用非致敏物：十二烷基磺酸钠、乳酸；弱致敏物：肉桂醇、丁香酚；中等致敏物：柠檬醛、肉桂醛、苯乙醛；强致敏物：没食子酸丙酯、马来酸酐；极强致敏物：苯醌、二硝基氯苯进行h-CLAT皮肤致敏的方法构建。建立方法后对样品：微乳卸妆液、松茸提取物、当归提取物和黄芩提取物进行预测。
　　第二部分、联合HaCaT角质细胞系和h-CLAT的皮肤致敏检测方法研究
　　1.细胞培养：
　　HaCaT角质细胞：使用RPMI1640培养基，10%的胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（双抗）；THP-1细胞与HaCaT细胞共培养采用BD Falcon插入式培养皿于12孔细胞培养板培养中孵育。
　　2.物质筛查：
　　使用十二烷基磺酸钠、丁香酚、肉桂醛和二硝基氯苯处理HaCaT角质细胞，分别获取4种物质对应的IC50；采用IL-18检测试剂盒检测上述4种物质作用后的HaCaT角质细胞和共培养系统的IL-18表达情况；构建HaCaT角质细胞与THP-1细胞的共培养皮肤致敏方法，并对上述4种物质的致敏性进行检测。
　　第三部分、联合EpiskinTM皮肤模型和h-CLAT的皮肤致敏检测方法研究
　　1.皮肤模型培养：
　　EpiskinTM皮肤模型：使用MEM培养基，该培养基为购买皮肤模型时附带。与THP-1细胞于12孔细胞培养板培养中共同孵育。
　　2.物质筛查：
　　使用十二烷基磺酸钠、丁香酚、肉桂醛和二硝基氯苯处理该共培养皮肤致敏检测系统，并与HaCaT角质细胞和THP-1细胞共培养系统的检测结果进行对比。最后，将建立的共培养系统对6种清洁类产品进行皮肤致敏性检测。
　　研究结果：
　　第一部分、h-CLAT皮肤致敏检测方法的研究
　　本研究对THP-1细胞进行了9种皮肤致敏阳性物质和2种皮肤致敏阴性物质的暴露，并对作用下的细胞活率、细胞表面分子CD54和 CD86进行检测，并获得相应的引起致敏反应的最低浓度EC150（CD86）和EC200（CD54）。方法顺利构建后，通过该方法对微乳卸妆液、松茸提取物、当归提取物和黄芩提取物进行了皮肤致敏检测，并判断当归和黄芩提取物为阳性物质，另外两种为阴性物质。
　　第二部分、联合HaCaT角质细胞系和h-CLAT的皮肤致敏检测方法研究
　　本实验中引入HaCaT角质细胞，并对受试物作用下角质细胞产生的炎性因子IL-18进行检测，发现其在单层角质细胞和共培养体系中都显著增加（P＜0.05）。随后，将无毒性情况下的IL-18联合DNCB作用THP-1细胞，结果与单独DNCB处理组并无显著性差异（P＞0.05）。后续对两种细胞的共培养系统分别检测SLS、丁香酚、肉桂醛和DNCB，发现相对h-CLAT皮肤致敏系统，共培养系统的CD86/CD54荧光强度并未显著增强（P＞0.05）。但是，该模型同一条件下可以检测物质的刺激性和致敏性，同时也为构建后续皮肤模型测试体系起到初筛受试物浓度的作用。
　　第三部分、联合EpiskinTM皮肤模型和h-CLAT的皮肤致敏检测方法的研究
　　为了优化HaCaT角质细胞与THP-1细胞的共培养模型，使用具有生物活性的皮肤三维结构模型EpiskinTM与THP-1细胞进行4种物质的皮肤致敏性检测。最终发现，3种阳性物质在皮肤模型整合h-CLAT测试条件下，相较于单纯的THP-1细胞皮肤致敏检测系统和THP-1细胞与HaCaT角质细胞共培养系统，相对荧光强度增加显著（P＜0.05）。最后，使用该模型对6种清洁类护理品进行了皮肤致敏检测。
　　研究结论：
　　本研究通过已知的9种皮肤致敏阳性标准物质和2种阴性物质建立了h-CLAT皮肤致敏测试方法，并对4种样品进行区分。同时，为了强化单一细胞检测体系，加入HaCaT角质细胞构建共培养模型，并对3种皮肤致敏阳性物质和1种阴性物质进行了准确区分，成功构建了基于IL-18细胞因子的皮肤刺激性和皮肤致敏性联合检测系统。最后，为更加契合化妆产品和个人护理品等物质对人体皮肤的作用条件，联合皮肤模型与THP-1细胞构建三维皮肤致敏评估结构，并对3种皮肤致敏阳性物质、1种阴性物质和6种清洁类成品进行了区分，结果表明该系统能够对皮肤致敏物质做出正确判断，并且相对上述两个检测系统受试物的检测类型更丰富。

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中文摘要

英文摘要

前言

1.皮肤致敏

2.皮肤致敏筛查方法

3.皮肤致敏有害结局通路

4.整合策略化测试方法

5.本文研究的目的和意义

第一部分 h-CLAT皮肤致敏检测方法的研究

1.材料与方法

2. 实验结果：

3.讨论

4.结论

第二部分 联合HaCaT角质细胞系和h-CLAT的皮肤致敏检测方法研究

1.材料与方法

2.实验结果：

3.讨论

4.结论

第三部分 联合EpiskinTM皮肤模型和h-CLAT的皮肤致敏检测方法研究

1.材料与方法

2.结果

3.讨论

4.结论

结论

参考文献

综述:基于AOP原理的皮肤致敏测试替代方法进展

附录

在研期间科研成绩

致谢