糖尿病自身抗体免疫渗滤联检试剂盒的研制及初步应用

摘要

背景:
　　糖尿病是一种多因素引起的复杂的代谢性疾病,发病率高、危害大,其中1型糖尿病和2型糖尿病是两个主要类型,因二者发病机制和治疗措施不同,目前糖尿病防治指南规定需予区分。1型糖尿病主要是由自身免疫性破坏胰岛P细胞导致胰岛素绝对缺乏而引起,其特征之一表现为外周血中出现针对胰岛卩细胞相关分子的自身抗体,这些自身抗体作为检测标志物,为糖尿病分型诊断提供了一个有效的解决途径。目前临床常用的胰岛素自身抗体(IA A)、谷氨酸脱羧酶自身抗体(GADA)、蛋白酪氨酸磷酸酶自身抗体(IA-2 A)在1型糖尿病中的阳性情况、持续时间和存在强度各具特点,单个指标的诊断价值尚存在缺陷。近年来新发现的锌转运体8自身抗体(ZnT8A)具有较好的检测敏感性和特异性,联合检测IAA、GADA、IA-2A、ZnT8A能够使不同的自身抗体优势互补,综合提高诊断效能。但常见的放射配体法和酶联免疫法主要对应单个项目的测定,以微孔板为反应载体存在板间差异和孔间差异问题,难以达到在同一条件下同时检测四项指标,导致联合检测成本高、耗时长、操作复杂、差异难控制等问题,使得该工作在临床开展受限。
　　目的:
　　以固相膜免疫反应原理为基础,建立糖尿病自身抗体斑点金免疫渗滤检测法,构建联合检测IAA、GADA、IA-2A、ZnT8A的血清学诊断试剂盒,使四项指标能够在同一条件下一次同时完成检测,有效减少检测差异并提高检测效率,为糖尿病自身抗体联合检测提供一种快速简便、准确高效且价廉易推广的新途径。
　　方法:
　　制备胶体金并标记链霉亲和素作为显色探针,将重组人胰岛素、谷氨酸脱羧酶、蛋白酪氨酸磷酸酶和锌转运体8抗原点样于硝酸纤维素膜上,设计生物素-链霉亲和素级联信号放大反应体系,探索并确定最优检测条件,建立糖尿病自身抗体斑点金免疫渗滤检测法。将免疫渗滤装置和配套试剂组成免疫渗滤联检试剂盒,初步应用于检测临床病例和健康对照标本,评估试剂盒性能。
　　结果:
　　1、自制的18nm胶体金经透射电镜鉴定具有良好分散性和均一性,以其成功标记链霉亲和素并获得高速离心纯化。
　　2、筛选确定了斑点金免疫渗滤法检测IAA、GADA、IA-2A、ZnT8A的最适反应条件,构建完成了免疫渗滤联检试剂盒并优化其制备工艺。
　　3、应用本试剂盒检测42例 T1DM敏感性为66.7％,检测100例健康对照特异性为97%。与E L IS A法比较在自身抗体阳性检出率上无显著差异(P>0.05)。采用3个批次的试剂盒检测结果一致,4°C干燥保存10周内检测性能稳定。
　　结论:
　　成功制备一卡四检(IAA、GADA、IA-2A、ZnT8A)的糖尿病自身抗体免疫渗滤联检试剂盒,初步应用具有良好检测性能和实用价值。

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第 一 章 前言

1.1 糖尿病自身抗体在糖尿病诊断分型中的重要价值

1.2 单个自身抗体的诊断价值有限，通过发现新的高效检测指标以及多种自身抗体联合检测能够显著提高诊断效能。

1 .3目前临床应用的窘迫现状是缺乏一种能够在同一条件下同时检测包括ZnT8A 在内的多种自身抗体的联合检测方式。

1 .4斑点金免疫渗滤法能够为多种糖尿病自身抗体的同时联合检测提供解决途径。

第 二 章 材 料 与 方 法

2 .1 材料

2 .2 标本

2 .3 制备胶体金颗粒

2 .4 胶体金标记链霉亲和素

2 .5 建立斑点金免疫渗滤检测方法

2 .6 优化免疫渗滤反应体系

2 .7 构建四种糖尿病自身抗体联合检测的免疫渗滤联检试剂盒

2 .8 酶联免疫法检测血清标本

2 .9 斑点金免疫渗滤法检测血清标本

第 三 章 结果

3 .1 胶体金的制备与鉴定

3 .2 胶体金标记链霉亲和素的制备与鉴定

3 .3 斑点金免疫渗滤检测法的建立和优化

3 .4 免疫渗滤联检试剂盒实体

3 .5 免疫渗滤法检测临床标本结果

3 .6 酶联免疫法检测临床标本结果

3 .7 免疫渗滤联检试剂盒诊断性能评价

3 .8 免疫渗滤联检试剂盒重复性试验结果

3 .9 免疫渗滤联检试剂盒稳定性试验结果

第 四 章 讨论

4 .1 胶体金的选择和制备

4 .2 胶体金标记链霉亲和素

4 .3 生物素-金标链霉亲和素信号放大检测体系

4 .4 试剂盒性能分析

全 文 结 论

参考文献

文献综述

参考文献

攻 读 学 位 期 间 研 究 成 果

致谢