FGF8及FGFR3在大骨节病软骨细胞异常分化过程中的作用研究

摘要

研究背景及目的：
　　大骨节病（Kashin-Beck disease,KBD）是一种慢性、地方性、变形性骨关节病，致残率很高，严重危害人民健康。我国曾将KBD列为卫生部“六五”、国家“七五”和“八五”科技攻关项目。但是，KBD发病机理不清，就推定的病因物质在人体内如何损伤深层软骨细胞，一直未获得证据，迄今不能解释KBD软骨深层坏死的发病机制。我们的前期研究发现，KBD的软骨坏死与氧化应激有关，KBD的发生发展是以自由基引起的氧化应激损伤作用为核心的病理过程。KBD软骨坏死以侵犯骺生长板和关节软骨的深层软骨细胞为主，由于透明软骨特殊的组织结构，在国内外的研究中，只要涉及关节和骺板软骨肥大层的病变，就会关注软骨细胞的分化调节作用。
　　成纤维细胞生长因子8(Fibroblast Growth Factor8，FGF8)是于90年代由外国学者在SC3即雄性激素依赖性小鼠乳腺癌细胞系中分离出来的，因此又被称为雄激素诱导的生长因子(androgen induced growth factor，AIFGF)。人体中的成纤维生长因子8是由233个氨基酸构成(其分子量约26 kDa)的碱性蛋白，等电电位点为105左右。其在细胞早期分化过程中起举足轻重的作用，并与头骨和大脑以及手脚骨骼等等的形成有着密切的联系，是由受精卵发育至胚胎这个过程中不可或缺的生长因子之一。成纤维细胞生长因子受体3(Fibroblast Growth Factor Receptor3，FGFR3)属于一类酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)。至今为止已经发现了4种成纤维细胞生长因子受体,即FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4。它们之间在氨基酸水平有55％~72%的一致性。通过既往研究我们得知,成纤维细胞生长因子受体3的信号通路与软骨的发育、再造和骨骼疾病有着紧密的联系。而成纤维细胞生长因子受体1,2,3的功能丧失突变或增强可导致包括颅缝早闭(craniosynostosis,CS)、软骨发育不全(achondroplasia,ACH)和CATSHL(camptodactyly,tall stature。scoliosis。and hearing loss)综合征在内的多种人类骨骼系统遗传性疾病。在已经报道的既往研究发现，KBD软骨内成骨障碍的发生涉及深层软骨细胞终末过程的分化异常，分化调节因子即成纤维细胞生长因子，甲状旁腺激素相关肽(Parathyroid Hormone related Peptide,PTHrp)，转化生长因子-β等表达异常，但这些异常表达的分化因子以及引起软骨细胞的终末分化障碍与 KBD深层软骨死亡的关系未见研究。
　　本研究拟以氧化应激所诱发的软骨细胞分化调节障碍为切入点，通过检测成纤维细胞生长因子8及其受体3在软骨细胞异常分化中的表达为介导，分析其与大骨节病患者的关系，并初步研究FGF以及FGFR在大骨节病的发生过程当中的生物学功能，试图揭示KBD软骨深层坏死的发病机制，进而为进一步阐明KBD的病因研究和防治提供理论依据。
　　研究方法：
　　本研究采用实时荧光定量Real-Time PCR、Western Blotting和免疫组织化学技术等方法，筛选异常表达的与软骨分化相关的分化调节因子-成纤维细胞生长因子及其受体，检测其在KBD儿童和动物模型软骨的表达水平，对KBD的病因及发病机制研究提供新的思路。
　　统计方法：
　　t检验主要用于大骨节病人组织与正常人对照组织的FGF8和FGFR3在免疫组织化学水平上阳性率表达差异的比较；动物模型的免疫组织化学水平上的差异比较用方差分析；卡方检验主要用于高表达组和低表达组的FGF8和 FGFR3在mRNA水平以及蛋白质水平上的差异比较。
　　结果：
　　1.各组SIN-1浓度梯度诱导下的小鼠关节软骨肥大细胞中FGF8以及FGFR3的mRNA和蛋白质的表达水平有差异，差异具有统计学意义（p?0.05）。与诱导成功的小鼠关节软骨肥大细胞对照组即SIN-10mmol（不加药）组相比，FGF8及FGFR3表达量上调，尤其是在ADTC5小鼠肥大软骨细胞系中。
　　2.在低硒条件下T-2毒素诱导的四组SD大鼠大骨节病模型的新鲜组织蛋白以及石蜡病理切片中检测异常表达的FGF8及FGFR3的表达水平，四组模型组织蛋白表达水平有差异，差异具有统计学意义（p?0.05）；四组模型石蜡病理切片的阳性率有差异，差异具有统计学意义（p?0.05）。与常规组相比，低硒组，常规+T-2组，低硒+T-2组中FGF8及FGFR3的表达水平上调。
　　3.免疫组织化学法检测了64例石蜡包埋软骨组织中FGF8以及FGFR3蛋白的表达情况，发现在儿童大骨节病患者手指关节软骨和成人KBD病人关节软骨中，FGF8以及FGFR3蛋白表达主要在细胞浆中，且病例组与对照组FGF8及FGFR3的阳性表达率具有差异，差异具有统计学意义（p?0.05）。
　　结论：
　　FGF8及FGFR3在大骨节病软骨细胞异常分化过程中具有重要作用，两个蛋白在软骨分化等功能上均为负调节蛋白，FGF8及FGFR3的表达上调可能会引起大骨节病的关节软骨分化障碍。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

1 前 言

1.1大骨节病的概述

1.2 自由基与骨关节病的关系

1.3 FGF及FGFR家族研究进展

1.4 FGF8及FGFR3蛋白与大骨节病软骨细胞异常分化的研究进展

2 材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3 结 果

3.1 ATDC5细胞培养及诱导鉴定

3.2实时荧光定量RT-PCR检测FGF8及FGFR3蛋白表达

3.3 FGF8及FGFR3蛋白在SD大鼠KBD模型软骨组织和软骨相关细胞系中的表达结果

3.4石蜡包埋软骨组织切片中FGF8及FGFR3的表达检测结果

4 讨 论

5 总 结

6 不足之处及展望

参考文献

研究生期间发表论文

附录 常用缩略词表

致谢

综述:FGFs及FGFRs与大骨节病的研究进展