基于SCR技术的自组装肽/脱钙骨基质促进骨修复的效果及机制研究

摘要

本论文的研究，首先尝试用自组装肽RADA16-Ⅰ修饰DBM，并分析SAP/DBM复合物的表征及稳定性;其次，通过SCR技术构建的SAP/DBM微环境，评价MSCs在微环境中的成骨分化;通过体内模型评价SCR技术构建的SAP/DBM复合物促进裸鼠异位及山羊原位临界骨缺损的修复效果;最后，探寻SCR技术构建的SAP/DBM复合物促进骨修复的可能机制。
　　目的：
　　1.用自组装短肽RADA16-Ⅰ修饰DBM，分析SAP/DBM的表征、稳定性等特性，为SCR技术寻求理想的支架材料;
　　2.通过体外MSCs在SAP/DBM微环境中的成骨分化及体内异位、原位骨修复研究，评价SCR技术下SAP/DBM的成骨效果;
　　3.进一步应用蛋白芯片技术等探寻SCR技术下SAP/DBM复合物促进骨修复的可能机制。
　　方法：
　　1.利用RADA16-Ⅰ肽的自组装特性，在PBS阳离子的触发下，启动自组装程序修饰DBM，形成SAP/DBM复合材料。通过原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)观察肽的自组装效果，环境扫描电镜(ESEM)观察其微观形态并测定孔径，X线光电子能谱(XPS)对其构成元素进行定性和定量检测，并进一步利用氨基酸对紫外光的敏感性，通过紫外分光光度仪全波长光谱分析SAP/DBM复合物的稳定性。
　　2.采用密度梯度离心法分离、培养羊（人）骨髓间充质干细胞(BMSCs)，通过MTT法检测BMSCs在SAP/DBM复合支架上的细胞增殖情况，并将BMSCs接种于SCR技术构建的富集骨髓的SAP/DBM微环境，通过激光共聚焦显微镜形态学观察、荧光实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）定量测定等方法评价SAP/DBM微环境对BMSCs的生长及成骨分化能力的影响。
　　3.制备裸鼠髂骨旁臀肌肌袋内异位成骨模型，通过Micro-CT定量计算、HE及Masson组织学染色评价SCR技术构建的SAP/DBM复合物的骨修复效果;并制备更具说服力的大动物原位骨缺损模型，综合运用X线、CT(Micro-CT)、组织学染色等多种方法，评价SCR技术下SAP/DBM复合物在术后8周、16周对山羊股骨中段2cm临界骨缺损的修复效果。
　　4.通过流式细胞技术分析SCR技术下SAP/DBM对骨髓中细胞的富集效果（评价指标包括粘附率、富集倍数等），免疫组化染色标记特异性细胞，高通量蛋白芯片技术分析SAP/DBM富集的蛋白种类及含量，结合裸鼠股四头肌肌袋内异位成骨模型，借助PCR技术分析成骨基因的表达水平，根据上述结果，并进一步利用蛋白芯片筛选技术分析上述结果中高表达水平的生长因子或蛋白分子在动物体内的表达水平、变化趋势及与其相关的蛋白间的相互关系。
　　结果：
　　1.在阳离子触发下，肽RADA16-Ⅰ可成功完成自组装，形成形状规则的立体纳米网状纤维结构，交织纤维形成的孔径多数在5～500 nm，浓度0.5％、1％(w/v)的肽自组装效果较理想。ESEM显示SAP/DBM的孔径为（20.22±6.726μm），为细胞的截留提供了物理结构;XPS通过不同材料的元素分析表明RADA16-Ⅰ与DBM的整合性良好;紫外分光光度仪分析结果显示SAP/DBM复合物具有良好的稳定性。
　　2.BMSCs典型特征为核浆比大，呈梭形或仿锥形，原代细胞生长较慢，第1代后生长旺盛。CCK-8试剂检测细胞增殖情况，发现羊骨髓间充质干细胞(gMSCs)在SAP/DBM支架上的增殖趋势明显优于DBM;细胞通过罗丹明-鬼笔环肽-DAPI染色后，共聚焦显微镜观察发现SAP/DBM复合支架上有更多的细胞，生长方向深入SAP网状结构内部，铺满整个SAP/DBM支架，而细胞在DBM支架多沿孔壁生长，铺展区域局限性明显;浓度0.5％、1％(w/v)的SAP与DBM组成的复合支架对gMSCs的生长情况无明显影响。RT-PCR发现浓度为0.5％、1％的肽构建的不同微环境可能对MSCs的成骨基因表达趋势具有一致性;7d时，SAP/DBM与DBM微环境上部分基因如OPN的表达水平未示显著的统计学差异，14d时，SAP/DBM上OCN和OPN基因的表达水平高于DBM，二者差异有显著统计意义(P＜0.05)，其可能原因在于SAP的纳米交织纤维结构构成的天然缓释系统对成骨因子具有储存、释放功能。
　　3.在裸鼠异位成骨实验中，术后8w，SAP/DBM组的新生骨诸多评价指标如骨量与骨体积比值(BV/TV)、骨小梁数量(Tb/N)、骨密度(BMD)均高于DBM组，二者间的差异有显著的统计学意义(P＜0.05，n=8)，组织学切片染色与Micro-CT结果相互印证，进一步说明SAP/DBM组新生骨的成熟度明显优于DBM组。在羊股骨临界骨缺损修复中，术后16w，SAP/DBM组在骨修复区的皮质骨重塑非常完整，新生骨形态接近正常骨组织，且骨纤维结构排列整齐，而DBM组呈现不完整愈合，新生骨呈现板层骨和编织骨混存结构，骨塑形尚不完全。同时发现浓度0.5％、1％的肽构建的复合物在成骨效果方面无明显差别，都具有良好的骨修复能力。
　　4.综合分析骨髓中细胞种类、不同种类细胞的粘附率、不同种类细胞的富集倍数等结果，认为SAP/DBM复合材料对骨髓中功能细胞的富集效果明显优于DBM; ESEM示SAP/DBM可均匀粘附骨髓中较多的有核细胞，而DBM仅粘附较多的红细胞和少量的有核细胞;这与HE染色结果相一致;免疫组化染色示SAP/DBM对单核细胞（CD14+）、造血干细胞(CD34+)、MSCs(CD73或CD90+)的粘附比例均明显大于DBM;蛋白芯片结果示SCR技术构建的SAP/DBM中富集的生长因子主要包括BMP-6、PDGF-BB、VEGF、EGF（浓度均＞10pg/ml）; SAP/DBM体内移植后PCR结果示Wnt/β-catenin/Runx-2信号通路可能在其成骨过程中发挥重要作用;进一步的蛋白芯片结果分析SCR技术富集的因子同信号通路相关分子间的关系时发现高浓度的PDGF-BB可能通过Akt信号激活NR4A1/SP1复合体募集宿主内源性的MSCs向骨修复区定向迁移，继而促进骨修复。
　　结论：
　　1.自组装肽RADA16-Ⅰ是一种良好的DBM仿生修饰材料，在生理条件下可自组装成纳米网状纤维结构，形成稳定的SAP/DBM复合物，其优良特性为体外细胞生物学研究和体内骨修复实验提供了基础。
　　2.BMSCs在SAP/DBM复合支架上的增殖趋势明显优于DBM支架，SCR技术构建的富集骨髓的SAP/DBM微环境较DBM更能诱导MSCs向成骨方向的分化。
　　3.SCR技术快速构建的SAP/DBM在裸鼠髂骨肌袋异位成骨中效果显著，在大动物原位骨缺损修复中，更能促进山羊股骨2cm临界骨缺损修复，同时明确了浓度0.5％和1％的肽构建的微环境对大动物原位骨缺损的修复效果无明显差别。
　　4.SCR技术快速构建的SAP/DBM的骨修复机制在于富集有较多的干细胞及较高浓度的生长因子，Wnt/β-catenin/Runx-2信号通路在骨修复中发挥重要作用，而PDGF-BB可能通过Akt信号激活NR4A1/SP1复合体募集宿主内源性的MSCs向骨修复区定向迁移，进一步发挥骨修复作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 SAP／DBM复合物的制备及表征评价

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 SAP／DBM促进MSCs体外成骨分化的实验研究

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 基于SCR技术的SAP／DBM复合物在体内促进骨修复的效果评价

4．1 RADA16-I／DBM骨髓复合物促进裸鼠异位成骨的效果分析

4．1．1 材料和方法

4．1．2 结果

4．1．3 讨论

4．2 RADA16-I／DBM骨髓复合物修复羊股骨临界骨缺损的效果评价

4．2．1 材料和方法

4．2．2 结果

4．2．3 讨论

4．3 小结

第五章 基于SCR技术的SAP／DBM复合物促进骨修复的机制研究

5．1 材料和方法

5．2 结果

5．3 讨论

5．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述 自体骨移植的替代方法及研究新进展

攻读博士期间发表论文情况

申请专利情况

致谢