酸敏感离子通道2a在脑缺血和脊髓损伤中的作用机制的研究

摘要

随着我国经济水平的提高、人们生活习惯的改变和交通情况的恶化，诸如脑缺血、脊髓损伤等神经系统的损伤越来越多。而此类的神经系统损伤不仅给个人的生活质量带来极大的损害，同时也给家庭和社会带来了巨大的负担。然而，目前对于脑缺血和脊髓损伤，临床上并没有有效的药物及方法治愈。据研究者报道，在脑缺血和脊髓损伤后，均会由于炎症和酸性产物堆积等原因引起局部环境酸化。随着局部环境的酸化，酸敏感离子通道（Acid Sensing Ion Channel，ASIC）就会被大量激活。ASIC通道家族有7个亚基，分别为1a、1b1、1b2、2a、2b、3和4。现在已经有大量研究表明ASIC1a在神经系统损伤中起着加速神经元死亡的作用，我们科室研究也发现ASIC1a介导了脊髓损伤后神经元的继发损伤。而ASIC2a的作用至今还没有明确的研究表明其在脑缺血及脊髓损伤中起着什么样的作用。所以，本研究旨在研究ASIC2a在脑缺血及脊髓损伤后的作用及机制。
　　目的：
　　1.观察ASIC2a在脑缺血后表达变化规律及其在脑缺血中的作用。
　　2.观察ASIC2a在脊髓损伤后表达变化规律及其在脊髓损伤中的作用。
　　3.探讨ASIC2a可能的作用机制。
　　方法：
　　1.采用大鼠大脑中动脉闭塞模型和脊髓损伤模型,应用组织病理学及TTC染色等方法,观察MCAO及SCI后组织病理变化过程。
　　2.应用westernblotting观察MCAO及SCI后ASIC2a表达变化规律及其变化意义。
　　3.应用病毒转染调节 ASIC2a的表达，然后通过 MTT染色、行为学评分、诱发电位等技术探讨ASIC2a在MCAO及SCI继发损伤中的作用及其机制。
　　结果：
　　1.大鼠大脑中动脉闭塞后，脑组织出现水肿，并在24小时以内，水肿面积不断扩大，脑组织细胞核固缩、细胞皱缩。大鼠则出现病灶对侧前爪屈曲、行走时转圈、向瘫痪侧摔倒并最终意识丧失及死亡，其中24小时死亡率高达45％。应用western blotting的方法检测发现ASIC2a水平在大脑中动脉闭塞及脊髓损伤后呈现逐渐升高的趋势。其中在大脑中动脉闭塞后，ASIC2a表现为持续升高，但是在损伤12小时后才出现明显的升高，差异有统计学差异（p<0.05）。病毒转染后ASIC2a水平受到明显调节。ASIC2a下调后，组织水肿明显加重，HE染色提示组织损伤加重，细胞核固缩，细胞核数目减少。应用TTC染色检测方法发现大鼠在大脑中动脉闭塞后，脑组织缺血面积在24小时内逐渐增大，在24小时达到最大。但是在下调ASIC2a表达后，缺血面积明显增大，其梗死率在12小时即达到37.4%，相对于MCAO组及空病毒组明显扩大。应用改良bederson评分评估大鼠MCAO后神经损伤情况。结果发现，MCAO后12小时，评分为ASIC2a下调组3.2、MCAO组2.3和空病毒组2.4，ASIC2a下调后神经功能明显下降。
　　2.Allen’s脊髓损伤模型参数为10g重物10mm下落砸击，砸击面积为2mm，砸击后损伤处周围即出现明显水肿，大鼠后肢即完全丧失运动能力，并有尿储留。在损伤后28天内，后肢运动能力呈现出逐渐恢复的趋势，且趋势较为稳定。应用western blotting的方法检测发现在脊髓损伤后，损伤中心0.5cm范围的脊髓组织内ASIC2a水平在3h后下降，然而，在损伤的头端和尾端0.5cm内ASIC2a则在3h后开始升高。ASIC2a改变有统计学意义（p<0.05）。病毒转染后ASIC2a水平受到明显调节。ASIC2a上调后，组织损伤情况减轻，存活细胞数目增多，细胞水肿减轻。ASIC2a下调后，则损伤加重。体外实验表明在神经元氧糖剥夺模型建立后，神经元数目明显下降，轴突明显缩短，同时细胞间连接也减少。而ASIC2a下调加重了氧糖剥夺给神经元带来的损害，上调ASIC2a则保护神经元减少受到氧糖剥夺的影响。MTT检测在神经元氧糖剥夺模型建立24小时后完成。实验表明氧糖剥夺模型减少了神经元活性，但是上调ASIC2a可以减轻这种效果，而下调ASIC2a则加重了氧糖剥夺对神经元的损伤。经SEP检测，正常大鼠体感诱发电位潜伏期为5.5ms,在脊髓损伤后7天潜伏期延长至21ms。但是在上调ASIC2a表达后，脊髓损伤的大鼠SEP潜伏期缩短至15.3ms，而下调ASIC2a表达后，潜伏期延长至25.6ms。大鼠脊髓损伤后28天内BBB评分，从记录结果中可以发现，假手术组无任何后肢运动功能障碍，28天内评分均为21分；脊髓损伤+空病毒（对照组）大鼠在伤后第3天出现后肢功能恢复，评分为1分，在第3天到第7天恢复速度较快，随后又趋于平缓，在伤后第28天评分可达到10.0±0.2分。而转染了ASIC2a干扰慢病毒的大鼠后肢运动功能恢复能力较差，伤后第3天仍然无可见的后肢运动，评分为0分，随后后肢运动功能缓慢恢复，到第28天时评分为5.8±0.1分；转染了ASIC2a过表达慢病毒的大鼠后肢恢复情况相对较好，伤后第三天即可恢复至2.6分，在随后到28天内，均有较多的恢复，第28天时评分可达到12.6±0.2分。
　　3.ASIC2a可以增加神经元对缺氧缺糖的耐受，减少神经系统酸中毒时的钙离子内流。
　　结论：
　　1.ASIC2a下调后MCAO后脑梗塞面积明显增加，动物也表现出更多的偏瘫症状。下调ASIC2a后，动物在SCI后明显表现出更糟糕的运动障碍和感觉障碍，脊髓组织损伤加重，神经元对缺氧的耐受也变差。反之上调ASIC2a则可以缓解这一系列症状，神经元对缺氧也更加耐受。
　　2.ASIC2a可能为一个内源性神经保护因子，在脑缺血和脊髓损伤后都有一定的神经保护作用。有可能成为以后临床上治疗脑缺血和脊髓损伤的一个新的靶标。

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缩略语表

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第一章 前言

1.1 研究背景

1.2 选题缘由

第二章 ASIC2a在脑缺血中的作用机制的研究

2.1 前言

2.2 材料和方法

2.2.1 主要动物

2.2.2 主要仪器设备仪器名

2.2.3 主要试剂试剂名

2.2.4 实验方法

2.3 实验结果

2.3.1 MCAO模型建立情况

2.3.2 MCAO后ASIC2a表达升高

2.3.3 慢病毒转染有效降低了ASIC2a的表达水平

2.3.4 TTC染色显示下调ASIC2a的表达增大了脑缺血区域

2.3.5 ASIC2a下调后组织损伤加重

2.3.6 ASIC2a水平下调以后大鼠神经功能下降

2.3.7 神经元鉴定

2.3.8 钙成像

2.4 讨论

第三章 ASIC2a在脊髓损伤中的作用机制的研究

3.1 前言

3.2 材料和方法

3.2.1主要动物

3.2.2 主要仪器

3.2.3实验方法

3.3 实验结果

3.3.1 动物模型的建立情况

3.3.2 脊髓损伤后ASIC2a表达水平变化

3.3.3 慢病毒有效调节了ASIC2a的表达水平

3.3.4 ASIC2a表达变化后体感诱发电位的变化

3.3.5 ASIC2a表达变化使神经元对氧糖剥夺耐受性改变

3.3.6 ASIC2a表达变化后后肢运动功能的变化

3.4 讨论

全文总结

参考文献

文献综述一:酸敏感离子通道ASIC在中枢神经系统中的病理和生理功能

文献综述二:脊髓损伤的继发损伤机制的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢