神经细胞摄取神经干细胞外泌体途径及其机制的初步研究

摘要

目的:
　　视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP)是一组基因介导的神经退行性视网膜疾病，目前仍没有有效的治疗手段。干细胞移植是目前最有前景的治疗方法之一，但作用机制仍不清楚，干细胞/前体细胞对损伤组织修复的机制仍存在争论。过去认为干细胞的治疗仅仅是通过细胞替代(cell replacement)发挥作用，但这一治疗机制由于仅有少部分在移植后期1-2个月细胞发生移行、整合而遭到质疑。目前研究认为旁分泌效应（bystander effects）而非仅是细胞替代介导了干细胞的治疗作用，而干细胞分泌的胞外囊泡(extracellular vesicles，EVs)可能参与了微环境调控和改善，从而发挥部分治疗作用。胞外囊泡(EVs)是细胞分泌的纳米级膜性囊泡，包含不同类型;主要为外泌体(exosomes，EXOs)、微囊泡(Multi-Vesicles，MVs)，它们在细胞间信号传导中发挥关键作用。目前对于这些囊泡的研究仍存在诸多问题和挑战，首先何种囊泡参与调控宿主细胞及微环境仍不清楚，其次虽然外泌体和细胞间的相互作用已经证实，但是外泌体与目标细胞结合后可能的交流机制仍缺乏广泛研究。在本课题中，将重点研究:1.小鼠神经干细胞胞外囊泡两种提取方法的比较;2.小鼠神经干细胞外泌体在3T3-fGFP细胞和神经系统细胞内吞中的通路机制。
　　方法:
　　1.用超速离心法获得胞外囊泡(EV)和Total Exosome Isolation Kit法富集外泌体(EXO);
　　2.形态学水平比较两种样品（透射电镜和原子力显微镜）;
　　3.蛋白水平比较两种样品（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹）;
　　4.脂质染料标记超速离心法获得外泌体;
　　5.3T3-fGFP细胞、原代LE大鼠皮层胶质细胞及原代LE大鼠海马神经元对C17.2细胞外泌体摄取方式研究;
　　6.3T3-fGFP细胞、原代LE大鼠皮层胶质细胞及大鼠少突胶质细胞系oli-neu细胞摄取C17.2细胞外泌体通路机制研究。
　　结果:
　　一、小鼠神经干细胞胞外囊泡两种提取方法的比较
　　1.C17.2神经干细胞生长良好，形态规则未出现明显分化现象，表明所提取囊泡来自小鼠神经干细胞所分泌。
　　2.透射电镜下EV和EXO均观察到圆形双层膜结构和“杯状”外形的囊泡，与之前文献报道一致，直径分布多集中在300nm以内，并且发现胞外囊泡的平均直径大于外泌体，提示两种方法提取的样品中除外泌体还有体积较大的其他类型囊泡。
　　3.原子力显微镜结果显示，EV和EXO的高度分布多集中在2-20nm以内，直径分布多集中在300nm以内，并且外泌体的平均高度和平均直径均大于胞外囊泡，提示超速方法提取的囊泡中从形态上分析是外泌体和更小囊泡组成的复合物，且以外泌体为主。
　　4.SDS-PAGE结果显示EV和EXO所含蛋白种类、表达丰度接近。在相同上样量下HSP70的表达强度两者接近，但CD63、CD9和CD81三种蛋白在胞外囊泡中表达更强，从蛋白水平证明超速离心方法提取的胞外囊泡中外泌体含量较高。
　　二、小鼠神经干细胞外泌体在3T3-fGFP细胞和神经系统细胞中摄取通路研究
　　1.摄取实验表明3T3-fGFP细胞、大鼠皮层胶质细胞和大鼠海马神经元细胞通过內吞通路摄取C17.2细胞外泌体，转运到细胞核周围的区域，并且內吞数量与时间相关，随着时间延长而增加。
　　2.这种內吞不仅可以发生在相同种属来源的小鼠神经干细胞与小鼠胚胎成纤维细胞之间，也可发生在不同种属来源的小鼠神经干细胞与大鼠神经系统细胞之间。
　　3.通过药理实验确定网格蛋白(Clathrin)介导的內吞通路为3T3-fGFP细胞、大鼠皮层胶质细胞和大鼠少突胶质细胞系oli-neu细胞內吞C17.2细胞外泌体的重要通路，使用网格蛋白通路抑制剂组內吞外泌体的数量明显减少。
　　结论:
　　1、本实验从形态学和蛋白水平证明使用的超速离心方法获得的胞外囊泡中主要包含外泌体，更加全面的证实该方法是一种简单、经济的外泌体收集方法。
　　2、本实验首次发现C17.2细胞来源的外泌体主要是通过內吞通路而非融合方式被3T3-fGFP、LE大鼠皮层胶质细胞及LE大鼠海马神经元细胞摄取，且內吞数量的增加呈现时间相关。并且这种內吞不仅可以发生在相同种属来源的神经干细胞与成纤维细胞之间，也可发生在不同种属来源的神经干细胞与神经系统细胞之间。
　　3、本实验率先提出了3T3-fGFP细胞、大鼠少突胶质细胞系oli-neur及原代LE大鼠皮层胶质细胞主要通过网格蛋白介导的內吞通路摄取C17.2细胞外泌体，而脂筏介导的內吞通路可能并不是这三种细胞內吞的主要通路。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 小鼠神经干细胞胞外囊泡两种提取方法比较研究

2．1 前言

2．2 材料和方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 小鼠神经干细胞外泌体在3T3-fGFP细胞和神经系统细胞中摄取通路研究

3．1 前言

第一节 小鼠神经干细胞外泌体在3T3-fGFP细胞和神经细胞摄取动力学研究

3．2 材料和方法

3．3 结果

第二节 小鼠神经干细胞外泌体在神经细胞摄取通路及机制研究

3．4 材料和方法

3．5 结果

3．6 讨论

3．7 小结

全文结论

参考文献

文献综述 胞外囊泡在神经系统中的生理作用和治疗应用

攻读学位期间发表的论文

致谢