电磁辐射对内嗅相关空间学习记忆的影响及其机制研究

摘要

近年来一个令人不容忽视的潜在性的健康危胁来自于电磁辐射，它主要包括电器等产生的工频辐射，也叫超低频辐射（ELF）和来自通讯所产生的射频或微波辐射（RF）。这是现代社会非常突出的一种污染。当前研究聚焦在ELF或RF与儿童白血病、脑肿瘤、致畸作用，神经类疾病、免疫功能下降，过敏及炎症反应，乳腺癌、流产及心血管疾病等方面。其中神经系统是电磁辐射损害的一个重要靶器官，有研究认为其与侧索硬化症、阿尔茨海默病、失眠、头痛、精力下降、学习记忆问题以及其它疾病有关。目前，有越来越多的证据表明电磁辐射对学习记忆功能有一定的影响，然而现在的研究并未能完全揭示电磁辐射对学习记忆功能影响的具体机制。
　　内嗅皮层（entorhinal cortex，EC）作为海马的门户联接着高级皮层与海马。基本的感觉信息传入主要依赖于 EC浅层（II/III层）的神经元。EC浅层的主要神经元的轴突构成穿通纤维，将皮层传来的信息传递到海马。这些信息到达海马的四个亚区：齿状回、CA3、CA1、下托。从II/III层发出的穿通纤维具有一定的区域选择性，II层的神经元的纤维选择性地投射到齿状回和CA3区，而III层的神经元选择性地投射到海马CA1区和下托。而从海马CA1区，信息也能够传递回EC的III、V、VI层和下托。
　　除了EC－海马之间的联系，EC也与各皮层之间有广泛的联系。简而言之，皮层输入形成两个群：投射到EC浅层（II/III层）的和投射到深层（V/VI层）的。这些解剖解构使得EC在新海马－EC－新皮层中扮演重要角色，也是情景记忆形成及巩固的重要基础。另外，EC皮层分为内侧EC（medial EC,MEC）及外侧EC（lateral EC，LEC）。目前认为MEC主要参与传递和处理空间信息，而LEC主要与非空间信息相关，所以，MEC在空间认知中的具有重要的意义。
　　本实验首先观察了50Hz，0.5mT的ELF对EC浅层主要神经元的树突棘密度及形状产生的影响。接下来我们通过全细胞膜片钳的记录技术，在脑片上检测电磁辐照对EC浅层的星形及锥体神经元电生理特性的影响。最后，我们运用旷场实验和水迷宫实验观察电磁辐射对动物运动功能及空间认识方面的作用。结果如下：
　　1.电磁辐射暴露对MEC浅层神经元树突棘密度及形态的影响
　　我们使用高尔基染色观察了大鼠的EC主要神经元。结果显示经过14天(86.42±2.77％of control,P<0.001)及28天(87.34±1.10%of control，P<0.001)的ELF暴露使得星形神经元以及锥体神经元的基树突棘下降，其中以纤细型树突棘和杯型树突棘最为明显。ELF使蘑菇型树突棘和树桩型树突棘密度的改变具有细胞类型的选择性。对于星形神经元，28天的ELF暴露使得树桩型树突棘密度略有上升(121.96±1.07% of control,P<0.05)，但此时长的暴露却并未影响蘑菇型树突棘(106.54±0.91%of control,P=0.45)。对于锥体神经元的基树突，我们只观察到较长时程的ELF暴露使得蘑菇型树突棘的密度有所下降(14天:115.59±1.99%of control，P=0.23;28天:88.64±0.70%of control,P=0.21)，然而与之相反的是，树桩型树突棘密度只在14天ELF暴露中下降(78.26±1.86%of control,P<0.05)，而在28天电磁暴露中得以恢复(93.73±0.68%of control,P=0.53)。总体来说，ELF暴露导致的锥体神经元顶树突棘密度的下降只在28天的ELF暴露中出现，反映电磁辐射对树突棘顶树突与基树突之间的一个攻击靶点。树突棘数量与形状的改变被认为与MEC的突触可塑性有密切联系，而MEC又作为学习与记忆中一个重要神经环路。以上这些发现可能是ELF暴露导致认知功能损害的一个重要机制。
　　2.超低频电磁辐射对MEC浅层星形及锥体神经元静息膜电位和膜阻抗的影响
　　我们采用脑片膜片钳技术直接观察50Hz，0.5mT，4h/d，7天的电磁辐射对EC浅层星形及锥体神经元的基本电生理特性及其兴奋性的影响。在电流钳模式下，将神经元的电流钳制在0pA，这样得到神经元的静息膜电位(resting membrane electric potential,RMP)。我们发现，星形神经元神经元（n=6，P=0.303）及锥体神经元（n=5,P=0.781）的静息膜电位并未受到电磁辐射的影响。通过记录电极给与记录细胞一系列由超极化到去极化的跃阶电流（-150～+250 pA，step=20pA，时长500ms）的刺激。得到电压－电流（I－V）曲线，而通过将I－V曲线进行线性拟合，得到神经元的膜电阻。我们发现，经过电磁辐射后，EC浅层的主要神经元星形神经元（n=6,P=0.936）以及锥体神经元（n=5,P=0.657）的膜电阻并未受到50Hz,0.5mT的工频电磁辐射的影响，表明ELF暴露并未影响细胞膜电位和膜阻抗。
　　3．超低频电磁辐射对MEC浅层星形及锥体神经元的全细胞电流的影响
　　电流钳模式下给予（-60～+30mV，step=+10mV,时长=500ms）的刺激，全细胞外向电流（whole-cell outward current）主要包括瞬时外向电流（transient outward current）和持续外向电流（sustained outward current），我们发现，电磁辐射并未影响到星形神经元的内向电流（control n=6，exposure n=5,P=0.428）以及锥体神经元的内向电流（n=5,P=0.310）。通过分析，我们发现，星形神经元的瞬时外向电流（control n=8，exposure n=5,P=0.199），锥体神经元的瞬时外向电流（control n=8，exposure n=5,P=0.358），星形神经元的持续性外向电流（control n=7，exposure n=5,P=0.409），锥体神经元的持续性外向电流（control n=6，exposure n=5,P=0.256）。以上结果初步表明电磁辐射未影响EC浅层主要神经元的电压门控离子通道的活动。
　　4.超低频电磁辐射对MEC浅层神经元兴奋性的影响
　　给予神经元以20pA递增的去极化刺激，在去极化刺激达到一定强度时，神经元将产生动作电位。EC浅层的星形神经元（control n=11，exposure n=8,P=0.614）以及锥体神经元（control n=6，exposure n=5,P=0.343）的动作电位发放频率均未受到影响，初步表明电磁辐射未影响神经元的兴奋性。
　　5.超低频电磁辐射对大鼠探索行为和运动功能的影响
　　我们使用旷场对动物探索行为和运动功能进行检测，电磁辐射组与对照组相比，对两者5分钟内行走的距离以及站立的次数进行统计。发现14天的电磁辐射组与14天对照组相比，运动距离（n=10,P=0.226）与探索次数（n=10,P=0.596）无统计学差异，同样，在28天的实验组中，运动距离（n=9,P=0.241）与探索次数（n=9,P=0.163）无明显变化。以上结果表明电磁辐射对动物探索行为和运动功能并无明显影响。
　　6.超低频电磁辐射对动物空间学习记忆的影响
　　经过对之前数据的分析，为了进一步验证电磁辐射是否会对空间学习记忆产生影响，我们采用水迷宫实验对动物空间学习记忆功能进行检测。电磁辐射暴露组与对照组之间水迷宫的逃避潜伏期并没有统计学差异：[14天：F(1,18)=0.27，P=0.61;28天：F(1,16)=0.60，P=0.45]。训练次数之间存在显著差异：[14天：F(7,126)=6.71，P<0.001;28天：F(7,112)=12.24，P<0.001]，训练次数与组间无明显交互作用：[14天：F(7,126)=0.37，P=0.95;28天：F(7,112)=0.68，P=0.69]，提示辐射组与对照组之间学习记忆获得的效率是相同的。
　　同时电磁辐射暴露组与对照组之间大鼠游泳的速度无统计学差异：[14天：F(1,18)=0.17，P=0.67;28天：F(1,16)=1.56，P=0.23]，从另一方面表明ELF并未影响动物的运动功能。

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缩略语表

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第一章 前言

第二章 电磁辐射对大鼠内嗅皮层浅层神经元树突棘的密度及形态的影响

2.1 材料与方法

2.1.1 主要仪器

2.1.2 实验方法

2.1.3 数据处理

2.2 结果

2.2.1 低频电磁辐射对内侧内嗅浅层主要神经元树突总长度的影响

2.2.2 低频电磁辐射对星形神经元树突棘形态和密度的影响

2.2.3 低频电磁辐射对锥体神经元树突棘的形态和密度的影响。

2.3 讨论

第三章 电磁辐射对神经元基本电生理特性的影响

3.1 材料与方法

3.1.1 材料

3.1.2 方法

3.2 结果

3.2.1 内嗅浅层星形神经元与锥体神经元的区分

3.2.2 电磁辐射对神经元静息膜电位与膜阻抗的影响

3.2.3 低频电磁辐射对神经元主要离子通道的影响

3.2.4 低频电磁辐射对神经元兴奋性的影响

3.3 讨论

第四章 电磁辐射对大鼠空间学习记忆的影响

4.1 材料和方法

4.1.1 主要仪器

4.1.2 实验方法

4.1.3 数据处理

4.2 结果

4.2.1 超低频电磁辐射对大鼠探索行为和运动功能的影响

4.2.2 超低频电磁辐射对大鼠空间学习记忆的影响

4.3 讨论

全文总结

参考文献

文献综述:树突棘形态功能与学习记忆之间的关系

攻读博士期间发表的论文

致谢