神经降压素NTS及其受体NTSR1对胶质瘤细胞增殖的影响及其分子机制

摘要

恶性胶质瘤是具有高度侵袭性和致死性的颅内原发性肿瘤，约占成人颅内原发恶性肿瘤的80％。尽管近年来综合治疗策略（联合手术、放疗和化疗）在临床中的广泛运用并取得了一定效果，但多形性胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme，GBM)患者的中位生存期仍然少于15个月。恶性增殖是胶质瘤细胞的生物学特点之一，导胶质瘤细胞恶性增殖的重要原因是肿瘤细胞基因组的不稳定和功能基因组的异常表达。因此，深入探讨胶质细胞增殖和肿瘤生长的分子机制将有助于解释其恶性增殖现象。
　　神经降压素(neurotensin，NTS)是由13个氨基酸残基组成的直链多肽，作为神经递质和激素样神经肽广泛分布并作用于中枢神经系统和消化系统。研究发现，神经降压素和高亲和力受体1(neurotensin receptor1，NTSR1)在多种肿瘤的病理进程中发挥了重要作用。因此，NTS/NTSR1有望成为肿瘤治疗的潜在靶点，但目前尚无文献报道NTS/NTSR1在恶性胶质瘤中的生物学效应及其分子机制。
　　微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类内源性、短链、高度保守的非编码RNA。miRNAs和相应蛋白形成RNA诱导的沉默复合物(RNA-induced silencing complex，RISC)，RISC作用于靶点mRNA的3端非转录区，以转录后调节方式抑制靶点mRNA翻译成蛋白质或降解该mRNA。生物信息学分析发现人体约有30％-60％基因的表达受到微小RNA的调控，其中包括众多细胞周期调控因子。
　　本研究采用体外和体内实验观察NTS/NTSR1、miRNAs和c-Myc对胶质瘤细胞增殖、细胞周期和移植瘤生长的影响;采用miRNAs芯片、荧光定量PCR和染色质免疫共沉淀(ChIP)实验论证NTS/NTSR1如何调控miRNAs的表达;采用荧光素酶报告基因和正反论证法观察miRNAs和CDKs之间的关联;采用western blot、荧光定量PCR和正反论证法探讨NTS/NTSR1如何调控CDK4的表达。旨在探讨NTS/NTSR1在胶质瘤细胞增殖中的生物学作用及其分子机制，为研究控制胶质瘤生长和改善患者预后提供实验依据和新的治疗靶点。
　　主要结果:
　　1.NTS/NTSR1促进胶质瘤细胞增殖、G1/S期进展和皮下移植瘤生长
　　NTS在体外具有促进胶质瘤细胞增殖和G1/S期进展的能力，而使用NTSR1的特异性拮抗剂SR48692或siNTSR1可以显著逆转NTS对细胞增殖和细胞周期进展的促进作用;沉默胶质瘤细胞NTSR1的表达可以显著抑制皮下移植瘤的生长;NTS/NTSR1对胶质瘤细胞增殖的影响主要通过调控G1/S期进展而不是通过影响细胞凋亡;NTS/NTSR1对G1/S期进展的促进作用主要通过在转录后水平调节CDK6的表达，在转录水平调节CDK4表达来实现。
　　2.NTS/NTSR1通过c-Myc/miR-29b-1和miR-129-3p调节CDK6蛋白的表达
　　NTS/NTSR1抑制胶质瘤细胞中miR-29b-1和miR-129-3p的表达，这两个miRNAs均可以作用于CDK6 mRNA的3端非转录区并抑制CDK6蛋白的表达;NTS/NTSR1通过促进转录因子c-Myc的表达继而作用于miR-29b-1的启动子并抑制其表达。
　　3.NTS/NTSR1通过转录因子c-Myc在转录水平促进CDK4的表达
　　NTS促进胶质瘤细胞中转录因子c-Myc的表达，该过程需要NTSR1的参与;转录因子c-Myc通过和CDK4的启动子结合继而促进CDK4的转录表达。
　　4.miR-29b-1、miR-129-3p和转录因子c-Myc影响胶质瘤细胞增殖、G1/S期进展、颅内原位移植瘤生长和荷瘤裸鼠生存时间
　　miR-29b-1和miR-129-3p抑制胶质瘤细胞增殖和G1/S期进展;在U87-NTSR1-SH细胞中干扰miR-29b-1和miR-129-3p的功能可以恢复颅内原位移植瘤的生长;在U87-NTSR1-SH细胞中过表达c-Myc或干扰miRNAs的功能均可以促进胶质瘤细胞增殖和G1/S期进展，两者联合运用具有协同促进作用。
　　综上所述，NTS/NTSR1可以在体外促进胶质瘤细胞增殖和G1/S期进展，在体内促进肿瘤组织的生长，而沉默NTSR1可以逆转上述现象;NTS/NTSR1通过抑制miR-29b-1和miR-129-3p表达继而解除这两个miRNAs对CDK6蛋白表达的抑制作用;NTS/NTSR1通过促进c-Myc表达一方面抑制miR-29b-1的表达，另一方面促进CDK4的转录;NTS/NTSR促进胶质瘤细胞增殖、G1/S期进展和肿瘤生长需要miRNA/CDKs轴和c-Myc/CDKs轴的参与。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 选题缘由

1．2 研究背景

1．3 研究意义

1．4 研究内容

1．5 研究方法

第二章 NTS小TSR1促进胶质瘤细胞周期进展，细胞增殖和肿瘤生长

2．1 材料和方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 NTS／NTSR1通过miRNA／CDKs和c-Myc／CDKs机制调控CDK4／6的表达

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第四章 NTS／NTSR1-miRNAs和NTS／NTSR1-Myc共同影响胶质瘤细胞的增殖活力

4．1 材料和方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述 microRNAs调控恶性胶质瘤细胞周期的研究进展

攻读学位期间的研究成果

致谢