DBP致男（雄）性生殖毒性中内质网应激及线粒体损伤的作用机制研究

摘要

邻苯二甲酸酯类(Phthalic acid esters，PAEs)是一类工业上大量生产的有机化合物。大部分PAEs以增塑剂的形式用于塑料制品中，同时也在化妆品、洗涤剂、农药、油漆、涂料等消费品中广泛使用。PAEs与塑料分子通常以非共价键形式结合，在特定条件下容易出现解离，进入周围的空气、土壤和水环境中，通过呼吸道、消化道或皮肤沾染的方式进入机体。因此，除了职业人群，普通人群也可通过多种途径接触PAEs，进而引起健康损害。研究表明，睾丸是PAEs最主要的靶器官，人群流行病学和实验研究均已证实PAEs暴露具有雄性生殖毒性。最近的动物实验研究显示，生精细胞凋亡可能是PAEs导致的雄性生殖毒性最主要的特征—睾丸萎缩的潜在机制。然而，PAEs诱导生精细胞凋亡的的分子事件及相关的分子信号通路仍然不十分清楚。近年来研究报道显示PAEs可以导致睾丸氧化性损伤和生殖细胞内质网扩张及线粒体水肿，提示内质网及线粒体氧化性损伤可能是其诱导生殖细胞凋亡的潜在分子机制。 目的:本课题使用邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)作为PAEs的代表化学物，在明确DBP可诱导睾丸生精细胞凋亡的条件下，研究内质网应激（Endoplasmic reticulumstress，ER stress）、线粒体损伤在DBP致雄性生殖毒性过程中的作用及机制，并进一步以我们建立的重庆大学生生殖健康(Male Reproductive Health in Chongqing CollegeStudents，MARHCS)队列人群为基础，验证PAEs引起的线粒体损伤效应。
　　方法:1.DBP诱导生精细胞凋亡过程中内质网应激和自噬作用的研究
　　建立小鼠生精细胞来源的GC-2细胞体外染毒模型，以CCK-8方法评价DBP对细胞的毒性效应;以ArmexinⅤ/PI染色检测DBP对细胞凋亡的影响。采用Western blot检测内质网应激相关蛋白标志物GRP78、p-eIF2α和ATF6的表达，以及内质网应激相关的凋亡标志物p-JNK/p-p38、CHOP和Caspase-12的表达;进一步采用内质网应激抑制剂4-PBA预处理细胞，研究内质网应激在DBP诱导的生精细胞凋亡中的作用。采用电镜观察DBP处理的GC-2细胞内自噬小体的水平;Western blot检测自噬标志蛋白LC-3和P62的变化;进一步采用内质网应激抑制剂4-PBA和自噬特异性抑制剂3-MA预处理细胞，研究细胞自噬在DBP诱导的生精细胞凋亡中的作用。此外，建立前青春期雄性大鼠的DBP染毒动物模型，通过体内实验验证DBP对生精细胞的毒性效应及内质网应激的作用
　　2.DBP诱导生精细胞凋亡过程中内质网应激介导的自噬分子机制研究
　　采用细胞自噬抑制剂氯喹(CQ)预处理细胞，进一步验证DBP激活自噬是否由于增加了GC-2细胞内的自噬流。进一步通过检测p-eIF2α/ATF4/Atg12、mTOR以及IRE1α/JNK/Beclin1通路中蛋白分子表达水平的变化，明确DBP诱导细胞自噬的分子通路。此外，检测DBP对GC-2细胞内ROS的影响，同时采用抗氧化剂褪黑激素(Melatonin)预处理细胞，研究细胞氧化应激在DBP诱导的内质网应激和自噬的作用。
　　3.PERK激活的Nrf2/ARE通路在DBP引起的线粒体损伤中作用的研究
　　通过检测线粒体质量、mtDNA拷贝数、ATP水平，以及Cyt C的释放和Caspase的活化，研究DBP对GC-2细胞的线粒体损伤及线粒体通路细胞凋亡的激活;进一步采用抗氧化剂Melatonin预处理细胞，明确DBP诱导的氧化应激在线粒体损伤的作用。此外，检测抗氧化通路Nrf2/ARE的激活状态及其与内质网应激相关通路PERK的关系，并分别采用PERK和Nrf2抑制剂预处理细胞，研究PERK与Nrf2/ARE通路之间的关系，以及Nrf2/ARE抗氧化通路在DBP诱导的线粒体损伤中的作用。
　　4.人群PAEs暴露对精子线粒体功能和mtDNA结构的影响
　　本课题组于2013年建立了“重庆市大学生男性生殖健康调查(Male ReproductiveHealth in Chongqing College Student，MARHCS)队列”，目的是研究社会-心理-行为因素和环境有害因素对男性生殖健康的影响。在2014年第一次人群随访阶段，本研究建立了反映人精子线粒体功能的线粒体膜电位(MMP)检测方法，以及反映线粒体DNA结构改变的mtDNA拷贝数与完整性的检测方法;进一步分析了精子线粒体相关指标与精液质量参数的相关性，同时研究个体尿液PAEs内暴露水平与精液参数及精子线粒体指标的关联。通过人群研究进一步验证PAEs对生精过程的线粒体损伤作用。
　　结果:1.内质网应激通过激活自噬对抗DBP诱导的生精细胞凋亡
　　结果显示，DBP对GC-2细胞有明显的毒性效应，并可诱导生精细胞凋亡，存在剂量-效应关系。DBP在低剂量水平即可提高细胞内GRP78、p-eIF2α和ATF6等内质网应激蛋白标志物的水平，提示DBP可诱导生精细胞的内质网应激;此外，内质网应激抑制剂4-PBA可加重DBP诱导的生精细胞凋亡，提示激活的内质网应激在DBP的生殖毒性中起保护性作用。进一步研究发现，DBP显著增加GC-2细胞内的自噬水平，而4-PBA预处理可明显抑制细胞自噬的发生，提示DBP诱导的细胞自噬是由内质网应激所介导;同时，自噬抑制剂3-MA预处理可明显加重DBP诱导的GC-2细胞凋亡，提示细胞自噬在DBP的生殖毒性中起保护作用。体内动物实验进一步证实，DBP能明显诱导睾丸生精细胞凋亡;4-PBA可降低DBP诱导的睾丸细胞自噬，并且4-PBA和3-MA处理均加重了DBP对睾丸的损伤。上述结果提示，内质网应激通过激活自噬对抗DBP诱导的生精细胞凋亡及睾丸损伤。
　　2.p-eIF2α/ATF4/Atg12通路介导了DBP诱导的内质网应激相关的自噬
　　研究显示，氯喹处理可增强DBP诱导的细胞自噬蛋白LC3-Ⅱ的表达，提示DBP诱导GC-2细胞自噬水平升高是由于自噬流的增加。细胞自噬分子机制研究表明，mTOR通路和JNK/Beclin1通路相关蛋白未发生明显改变，而p-eIF2α/ATF4通过调节Atg12的表达，介导了DBP诱导的生精细胞自噬。进一步的实验发现，DBP能显著增加GC-2细胞内的ROS水平，而抗氧化剂Melatonin预处理可明显抑制ROS水平的增加，并降低DBP诱导的GC-2细胞内质网应激和自噬，提示氧化应激可能参与DBP诱导的生精细胞异常改变。
　　3.PERK激活Nrf2/ARE抗氧化通路对抗DBP诱导的生精细胞线粒体损伤
　　DBP处理可诱导GC-2细胞线粒体质量下降、mtDNA拷贝数降低和ATP合成下降，并且明显诱导线粒体途径的细胞凋亡，而抗氧化剂Melatonin可降低DBP诱导的线粒体损伤和凋亡。进一步研究发现，DBP激活了细胞内Nrf2/ARE抗氧化反应通路，而Nrf2 siRNA预处理后，可显著加重DBP诱导的细胞线粒体损伤和凋亡。此外，采用内质网应激相关分子PERK的特异性抑制剂处理后，Nrf2/ARE抗氧化通路的活化水平下降，并且加重了DBP诱导的细胞线粒体损伤。体内动物实验进一步证实，PERK抑制剂处理可降低睾丸组织中Nrf2/ARE通路的激活，并加重DBP诱导的睾丸生精细胞线粒体途径的凋亡。
　　4.人群PAEs暴露对精子线粒体功能和mtDNA结构的影响
　　人群研究表明，精子线粒体的膜电位、mtDNA拷贝数和mtDNA完整性与精液质量参数密切相关，提示上述线粒体相关指标可能成为反映精液质量的生物标志物。分析进一步发现，尿液中PAEs代谢物MEP、MnBP和MCPP水平与精子前向活力呈明显的负相关，MEHP水平与线粒体膜电位正相关，高暴露DEHP或尿中MCHP、MnOP、MBzP和MiNP单酯水平高的人群mtDNA完整性明显较差，提示人精子的线粒体可能是PAEs致男性生殖损伤的一个靶。
　　结论:DBP可诱导睾丸毒性、生精细胞的氧化应激及线粒体途径的凋亡，同时，DBP也激活细胞内的自我防护机制—内质网应激，一方面通过p-eIF2α/ATF4/Atg12通路激活细胞自噬，另一方面通过PERK信号激活Nrf2/ARE抗氧化通路，对抗DBP引起的生精细胞凋亡。人群研究发现，个体的PAEs尿中代谢物水平与精子mtDNA完整性降低显著相关，进一步证实了PAEs化学物可造成生殖细胞的线粒体损伤及相应的生殖毒性，并提示线粒体相关的指标可以作为反映男性生殖能力的生物标志物。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 DBP诱导生精细胞凋亡过程中内质网应激和自噬作用的研究

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 DBP诱导生精细胞凋亡过程中内质网应激介导的自噬分子机制研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 PERK激活的Nrf2／ARE通路在DBP引起的线粒体损伤中作用的研究

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 人群PAEs暴露对精子线粒体功能和mtDNA结构的影响

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．3 实验结果

5．4 讨论

5．5 小结

全文总结

参考文献

文献综述 邻苯二甲酸酯致雄性生殖毒性机制的研究进展

攻读博士学位期间的研究成果

致谢