正常猕猴玻璃体腔注射人源黑视蛋白腺相关病毒表达及安全性研究

摘要

目的:
　　首先通过人源黑视蛋白腺相关病毒(pAAV2/8-CMV-hMel-p2A-YFP)转染离体培养的293T细胞、正常大鼠原代视网膜节细胞、正常大鼠视网膜，验证构建的病毒载体转染及表达性能。进一步通过对猕猴行两种术式(1.直接玻璃体腔注射;2.内界膜剥除+玻璃体腔注射)病毒注射，观察该病毒在灵长类动物体内的转染及表达，并对比两种术式对病毒表达的影响;探索正常猕猴视网膜节细胞表达人源黑视蛋白的对光反应功能;观察手术方式及病毒在猕猴体内转染的安全性。为该光遗传治疗策略在治疗人视网膜变性疾病提供理论基础和实践指导。
　　方法:
　　1.将构建的共表达人源黑视蛋白及YFP荧光蛋白的腺相关病毒，通过体外转染离体细胞(293T细胞系，正常大鼠原代视网膜节细胞)及在体转染正常大鼠视网膜观察人源黑视蛋白及YFP的表达，验证该病毒的转染、表达能力。
　　2.将3只正常猕猴的6眼分为两组，3只右眼为一组，行后段玻璃体切除+内界膜剥除+C3F8气体填充+玻璃体腔注射30μL构建的腺相关病毒(病毒滴度9.71×1012v.p/mL);3只左眼为一组，直接玻璃体腔注射30μL病毒，注射病毒3个月后腹腔注射戊巴比妥钠将猕猴安乐死，取下视网膜计数猕猴视网膜YFP阳性细胞，对比内界膜剥除对病毒转染效率的影响，并采用全细胞膜片钳技术记录YFP阳性细胞的对光反应功能。
　　3.术前及术后1月、2月、3月对猕猴行眼底照相、自发荧光、OCT等眼部形态学检测;术前及术后3月对猕猴的FERG、FVEP指标进行检测，并行统计学分析，观察病毒的注射及手术的处理是否会引发严重的眼部并发症。
　　4.术前及术后3个月对猕猴外周血中炎症因子、肝功能、肾功能等血液检验学指标进行检测，并行统计学分析，研究我们所使用的腺相关病毒是否会引起正常猕猴全身严重的免疫、炎症反应。
　　5.术后3个月腹腔注射戊巴比妥钠将猕猴安乐死，对心脏、肝脏、肾脏等全身脏器行组织病理学观察，研究我们所使用的腺相关病毒是否会引起基因突变，导致肿瘤等疾病的发生。
　　结果:
　　1.构建的人源黑视蛋白腺相关病毒在体外细胞系(293T细胞系、原代神经元)及正常啮齿类动物(LE大鼠)视网膜均有较好的转染力，可共表达人源黑视蛋白及YFP荧光蛋白。
　　2.构建的人源黑视蛋白腺相关病毒在正常猕猴视网膜有较好的转染力，YFP荧光蛋白主要表达于节细胞，视网膜铺片可见YFP阳性细胞的分布均为周边高，中央低，内界膜剥除眼和直接玻璃体腔注射眼之间未见统计学差异。
　　3.全细胞膜片钳技术记录到470nm蓝光刺激时，猕猴视网膜YFP阳性神经节细胞能够对光反应，产生内向电流及动作电位。
　　4.术前及术后1月、2月、3月眼底照相、眼底自发荧光、OCT等形态学检测结果表明:内界膜剥除眼术后可见内界膜剥除证据，未见手术并发症，眼部功能学检测(FERG，FVEP)术前及术后3个月比较无统计学差异。
　　5.血液检验学指标结果表明:猕猴肝功能、肾功能、心肌酶谱、炎性因子等指标术前及术后3月对比未见统计学差异。
　　6.全身各脏器石蜡切片HE染色未见明显病理学改变。
　　结论:
　　1.证实了构建的人源黑视蛋白腺相关病毒转染及表达能力正常，可共表达人源黑视蛋白及YFP荧光蛋白。
　　2.证明了在正常猕猴非感光视网膜神经节细胞能够通过光遗传学技术表达人源黑视蛋白，获得对光反应功能。
　　3.建立了猕猴后段玻璃体切除+内界膜剥除+C3F8气体填充+玻璃体腔注射病毒的手术方式，研究了正常猕猴玻璃体腔注射和内界膜剥除+玻璃体腔注射两种转染方式对转染率的影响，确定了直接玻璃体腔注射转染的优势。
　　4.证明了通过光遗传学技术在灵长类动物视网膜表达人源黑视蛋白的安全性。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 前言

第二章 正常猕猴玻璃体腔注射人源黑视蛋白腺相关病毒表达研究

2．1 引言

2．2 人源黑视蛋白腺相关病毒转染及表达能力验证

2．2．1 材料和方法

2．2．2 结果

2．3 正常猕猴玻璃体腔注射人源黑视蛋白腺相关病毒的手术方式研究

2．3．1 材料和方法

2．3．2 结果

2．4 正常猕猴玻璃体腔注射人源黑视蛋白腺相关病毒表达及功能检测

2．4．1 材料和方法

2．4．2 结果

2．5 讨论

2．6 小结

第三章 正常猕猴玻璃体腔注射人源黑视蛋白腺相关病毒安全性研究

3．1 引言

3．2 人源黑视蛋白腺相关病毒载体安全性研究

3．2．1 材料和方法

3．2．2 结果

3．3 人源黑视蛋白腺相关病毒携带基因的安全性研究

3．3．1 材料和方法

3．3．2 结果

3．4 讨论

3．5 小结

全文结论

参考文献

文献综述 黑视蛋白研究进展

攻读硕士学位期间的研究成果

致谢