机械牵伸通过Wnt5a、Wnt5b/JNK信号通路促进大鼠肌腱干细胞成骨分化

摘要

背景和目的:
　　肌腱病(Tendinopathy)是骨科常见疾病，常见的肌腱病有跟腱炎、网球肘、冈上肌腱炎等三十余种，职业运动员发生肌腱病往往意味着运动生涯的终结，目前对肌腱病尚无有效的治疗方法。肌腱组织中出现异位骨化和脂肪组织是肌腱病的主要病理表现[1]，多数学者认为过度使用导致的肌腱损伤是肌腱病的主要致病原因，但其致病机制不详。2007年Bi等[2]在肌腱组织中分离出了干细胞，称为肌腱干细胞(Tendon stemcells，TSCs)，TSCs是肌腱细胞的前体细胞，具有多向分化潜能。Gulotta等[3]证实TSCs具有间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)和骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells，BMSCs)相似的生物学特性，TSCs对于肌腱细胞再生及肌腱损伤的修复起重要作用。体外研究发现，TSCs细胞形态的改变可以影响其分化方向，对TSCs施加4％强度的机械牵伸应力，TSCs主要分化为肌腱细胞，参与肌腱细胞更新及肌腱组织修复，在8％强度的机械牵伸下，TSCs主要分化为非肌腱细胞（骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞）[4]，然而机械牵伸引起TSCs发生成骨分化的分子生物学机制尚不清楚。研究机械牵伸条件下TSCs向骨细胞分化的分子生物学机制，对于揭示肌腱病的发病机制具有重要意义。
　　我们研究大鼠肌腱来源干细胞(rat tendon-derived stem cells，rTDSCs)在机械牵伸应力诱导下的成骨分化能力;检测在机械牵伸应力诱导下非经典Wnt信号通路中的Wnt5a、Wnt5b基因及蛋白水平的表达;磷酸化JNK(Phosphorylated JNK，P-JNK)水平;以及Wnt5a，Wnt5b与JNK间的相互调控关系;研究机械牵伸应力是否通过Wnt5a/Wnt5b/JNK信号通路调控rTDSCs的成骨分化，探究肌腱组织异位骨化的形成机制。
　　方法:
　　第一部分:rTDSCs干细胞特性及多向分化能力的鉴定。自大鼠跟腱组织中分离、培养细胞，用流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)测定细胞的表面标记物:CD31抗体、CD44抗体、CD90抗体、CD34抗体，用免疫荧光法检测核干细胞因子抗体(nucleostemin)、Nanog抗体、八聚体结合转录因子4抗体(octarner-binding transcriptionfactor4，Oct-4)。加入干细胞成骨诱导培养基做成骨诱导实验，加入普通生长基(growthmedium，GM)作为对照，成骨诱导21天后提取RNA，用实时定量聚合酶链式反应(real-time Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)检测成骨基因Runx2、DIX5 mRNA表达，并做茜素红染色实验;用干细胞成脂诱导培养基做成脂诱导实验，而加入GM作为对照组，成脂诱导14天后提取RNA，RT-PCR检测成脂基因PPARγ、ap2 mRNA表达，并做油红染色实验;用干细胞成软骨诱导培养基做成软骨诱导实验，在诱导21天后将形成的软骨团块切片做阿尔新蓝染色。
　　第二部分:检测rTDSCs经单轴机械牵伸(uniaxial mechanical tension，UMT)诱导后的成骨分化能力。rTDSCs在牵伸频率为1HZ、牵伸强度为8％的条件下经UMT诱导48、60、72h，用RT-PCR检测成骨基因Runx2，Dlx5，Alpl, Col1a1 mRNA相对于非牵伸对照组(non-loading control，NC)的表达，用免疫印迹法(western blot，WB)测定Runx2蛋白相对于NC的表达，并做碱性磷酸酶染色实验。
　　第三部分:rTDSCs经UMT诱导48、60、72h后检测Wnt5a、Wnt5b、Ror2、Rac1mRNA相对于NC的表达。在UMT诱导48、60h后WB检测Wnt5a、Wnt5b蛋白相对于NC的表达。
　　第四部分:研究Wnt5a及Wnt5b是否调控UMT诱导的Runx2蛋白表达。用短发夹RNA（short hairpin RNA，ShRNA）慢病毒分别干扰rTDSCs的Wnt5a及Wnt5b基因，然后rTDSCs经UMT诱导60h，WB检测Runx2蛋白相对于慢病毒对照组的表达。
　　第五部分:分别用4％、8％强度的UMT诱导rTDSCs24h，用罗丹明-鬼笔环肽染色法检测rTDSCs的细胞骨架改变。rTDSCs经UMT诱导48、60h后检测P-JNK水平。UMT诱导前30min，在rTDSCs培养基中分别加入JNK兴奋剂茴香霉素(anisomycin，AM)、JNK抑制剂SP600125，UMT诱导60h后WB检测Runx2蛋白相对于未加药物干预组的表达。分别用互补脱氧核糖核酸(cDNA)过表达rTDSCs的JNK基因、shRNA干扰rTDSCs的JNK基因，然后施加UMT诱导，进一步证实JNK对UMT诱导的rTDSCs成骨分化具有调控作用。
　　第六部分:分别用shRNA干扰rTDSCs的Wnt5a、Wnt5b基因，施加UMT诱导后同时检测P-JNK水平和Runx2蛋白表达，研究Wnt5a、Wnt5b是否对JNK有调控作用;证实UMT通过Wnt5a/Wnt5b/JNK信号通路促进rTDSCs的成骨分化。
　　结果:
　　第一部分:在大鼠跟腱组织中分离、培养细胞，流式细胞分析表明细胞表面标记物CD90抗体阳性，免疫荧光检测表明核干细胞因子抗体、Nanog抗体、Oct-4抗体阳性。加入成骨诱导培养基组的成骨基因Runx2、DIX5 mRNA表达较GM组明显升高，成骨诱导后茜素红染色阳性;加入成脂诱导培养基组的成脂基因PPARγ、ap2 mRNA表达较GM组明显升高，油红染色阳性;细胞经成软骨诱导21天后形成软骨团块，阿尔新蓝染色阳性。
　　第二部分:rTDSCs经UMT诱导48、60、72h后成骨基因Runx2，Dlx5，Alpl, Col1a1mRNA表达较NC组高，Runx2蛋白水平也较NC组高。rTDSCs经UMT诱导72h后ALP染色阳性。
　　第三部分:rTDSCs经UMT诱导48、60、72h后Wnt5a、Wnt5b、Ror2、Rac1 mRNA表达相对于NC升高，WB检测Wnt5a、Wnt5b在UMT诱导48、60h的蛋白表达相对于NC组升高。
　　第四部分:用shRNA干扰Wnt5a、Wnt5b基因，经UMT诱导60h后提取蛋白做WB检测，结果Runx2蛋白表达较慢病毒对照组下降。
　　第五部分:罗丹明-鬼笔环肽染色显示，rTDSCs经UMT诱导后细胞骨架发生不可逆改变，UMT可上调P-JNK水平（相对于NC组），JNK兴奋剂AM及抑制剂SP600125分别促进及抑制UMT诱导的Runx2 mRNA及蛋白表达。用cDNA及shRNA干扰JNK基因，分别促进及抑制UMT诱导的Runx2表达。
　　第六部分:shRNA干扰rTDSCs的Wnt5a、Wnt5b基因可抑制UMT诱导的Runx2蛋白及P-JNK表达，Wnt5a、Wnt5b shRNA对UMT诱导的Runx2抑制作用可通过JNK兴奋剂AM解救。
　　结论:
　　第一部分:从大鼠跟腱分离、培养的细胞采用FCM及免疫荧光检测具有干细胞的特性，并且这种细胞具有向骨细胞、脂肪细胞软骨细胞分化的能力。
　　第二部分:rTDSCs经UMT诱导后Runx2的mRNA及蛋白水平均较NC组升高，ALP染色阳性，UMT可以诱导rTDSCs成骨分化。
　　第三部分:rTDSCs经UMT后Wnt5a、Wnt5b高表达，表现为Wnt5a、Wnt5b的mRNA及蛋白表达较NC组升高。
　　第四部分:非经典Wnt信号通路中的Wnt5a、Wnt5b对UMT诱导的rTDSCs成骨分化具有调控作用。
　　第五部分:UMT诱导后，rTDSCs的细胞骨架发生不可逆改变，并且JNK磷酸化水平较NC组升高，JNK对UMT诱导的rTDSCs成骨分化也具有调控作用。
　　第六部分:rTDSCs在UMT诱导条件下，Wnt5a、Wnt5b对JNK有调控作用，rTDSCs在UMT诱导下的成骨分化可通过Wnt5a、Wnt5b/JNK信号通路调控。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 大鼠肌腱来源干细胞培养、鉴定及多向分化能力的检测

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 rTDSCs在机械牵伸条件下的成骨分化能力研究

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 机械牵伸对Wnt5a、Wnt5b表达的影响

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 实验结果

4．4 讨论

4．5 小结

第五章 rTDSCs在UMT诱导下的成骨分化由Wnt5a、Wnt5b调控

5．1 引言

5．2 材料与方法

5．3 实验步骤

5．4 实验结果

5．5 讨论

5．6 小结

第六章 JNK对UMT诱导的rTDSCs成骨分化的作用研究

6．1 引言

6．2 材料与方法

6．3 实验步骤

6．4 实验结果

6．5 讨论

6．6 结论

第七章 UMT诱导下的rTDSCs成骨分化受Wnt5a／Wnt5b／JNK信号通路调控

7．1 引言

7．2 材料与方法

7．3 实验结果

7．4 讨论

7．5 结论

全文总结

参考文献

文献综述 肌腱病与肌腱干细胞的研究进展

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢