神经干细胞与RPE细胞的线粒体交换及其对RCS大鼠RPE细胞线粒体功能影响的研究

摘要

背景和目的：
　　近年来年龄相关性黄斑变(age-related macular degeneration，AMD)的发病率逐年上升，其主要病理改变是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)细胞的变性、坏死、丢失。RPE细胞位于视网膜的最外层，其主要功能包括形成血视网膜屏障、分泌神经营养因子、参与视黄醇循环、吞噬感光细胞外节、吸收可见光及抗氧化应激等。RPE细胞正常生理功能的发挥需要充足的能量供给，同时也会产生大量的活性氧类(reactive oxygen species，ROS)。RPE细胞的线粒体是能量产生及ROS清除的关键细胞器，也是RPE细胞最先及最易受到损伤的细胞器。最近研究显示RPE细胞线粒体功能障碍与视网膜色素变性的发生密切相关。
　　干细胞来源的RPE细胞移植是目前治疗AMD等致盲性眼病最有前景的治疗手段，其治疗机制主要包括:短期的神经营养效应(by stander效应)以及长期细胞替代效应(cell replacement)。近来发现间充质干细胞能够通过线粒体交换改善受者细胞功能。考虑到AMD等视网膜变性疾病的发病机制与RPE细胞线粒体功能障碍密切相关，有报道显示RPE细胞系(ARPE19)间可形成TNT结构并进行线粒体交换，目前尚无相关文献报答线粒体交换对RPE细胞功能的影响。
　　本研究主要探索神经干细胞能否与原代分离的LE大鼠和RCS大鼠RPE细胞形成TNT结构并进行线粒体交换，线粒体交换对RPE细胞能量代谢、ROS代谢和细胞增殖的影响。初步探讨线粒体交换这一机制是否参与干细胞治疗视网膜变性疾病。
　　方法:
　　第一部分:小鼠神经干细胞与正常RPE细胞TNT的形成及线粒体交换
　　1.用带有红色荧光和绿色荧光的线粒体特应性标记物(Mitotracker-red，Mitotracker-green)分别标记mNSC与ARPE19细胞后1∶1等量直接共培养24 h，于激光扫描共聚焦显微镜下观察TNT的形成及线粒体交换。
　　2.用带有红色荧光和绿色荧光的线粒体特应性标记物(Mitotracker-red，Mitotracker-green)分别标记mNSC与原代分离的LE大鼠来源的RPE细胞后，取等量细胞1∶1直接共培养24 h，于激光扫描共聚焦显微镜下观察线粒体交换。
　　第二部分:小鼠神经干细胞与RCS大鼠RPE细胞的线粒体交换及其对RPE细胞功能的影响
　　1.收集单独培养的LE大鼠来源的原代RPE（LE-RPE）、与mNSC等量直接共培养48 h后经流式细胞术分选所获得的原代LE大鼠RPE细胞(LE-RPE/mNSC)，采用高效液相色谱检测其腺苷酸含量，采用流式细胞术检测细胞周期、细胞ROS水平。
　　2.收集第三代的LE大鼠来源的原代RPE细胞（LE-RPE）及RCS大鼠来的源RPE细胞（RCS-RPE），采用高效液相色谱检测其腺苷酸含量，采用流式细胞术检测细胞周期、细胞ROS水平。
　　3.收集单独培养的RCS大鼠来源的原代RPE细胞(RCS-RPE)、与mNSC等量直接共培养48 h后经流式细胞术分选所获得的原代RCS大鼠RPE细胞(RCS-RPE/mNSC)，采用高效液相色谱检测其腺苷酸含量，采用流式细胞术检测细胞周期、细胞ROS水平。
　　结果:
　　第一部分:小鼠神经干细胞与正常RPE细胞TNT的形成及线粒体交换
　　1.激光扫描共聚焦显微镜下可见mNSC与ARPE19细胞共培养24h后形成TNT，并且mNSC通过TNT将线粒体转运至ARPE19中。
　　2.激光扫描共聚焦显微镜下观察到LE大鼠来源的原代RPE(LE-RPE)与mNSC间形成TNT，随着时间的推移，NSC的线粒体通过TNT进入LE-RPE中。
　　第二部分:小鼠神经干细胞与RCS大鼠RPE细胞的线粒体交换及其对RPE细胞功能的影响
　　1.LE-RPE与mNSC共培养后ATP、ADP、AMP含量以及腺苷酸池总量及能荷均下降，但差异无统计学意义;共培养组ROS水平较未共培养组稍有降低，差异无统计学意义;共培养组与未共培养组相比G1期的细胞比例明显降低，S期及G2/M期细胞的比例分别增加，细胞增增殖指数(PI)也明显增加，差异有统计学意义。说明干细胞能够通过将线粒体转运至LE-RPE细胞改善其增殖能能力。
　　2.RCS-RPE与LE-RPE相比ATP、ADP、AMP含量以及腺苷酸池总量及能荷均下降;RCS-RPE的ROS水平高于LE-RPE;RCS-RPE G1期的细胞比例高于LE-RPE，S期及G2/M期细胞的比例分别低于LE-RPE，细胞增增殖指数低于LE-RPE。差异有统计学意义。说明RCS大鼠来源的RPE细胞存在能量代谢缺陷、抗氧化应激能力缺陷和增殖能力下降。
　　3.RCS-RPE与mNSC共培养后ATP、ADP、AMP含量以及腺苷酸池总量及能荷均下降，但差异无统计学意义;共培养组ROS水平较未共培养组明显降低，差异有统计学意义;共培养组与未共培养组相比G1期的细胞比例明显降低差异有统计学意义，S期及G2/M期细胞的比例分别增加，细胞增增殖指数也明显增加，差异均有统计学意义。说明接收了干细胞的线粒体的RCS-RPE细胞的线粒体相关功能得到改善，能量代谢障碍得到纠正。
　　结论:
　　1.神经干细胞能与ARPE19细胞株及原代分离的RPE细胞形成TNT结构，并通过TNT进行线粒体交换。
　　2.和LE-RPE细胞相比，RCS-RPE细胞ATP含量下降、ROS水平显著升高及细胞增殖能力下降，说明变性RCS大鼠的RPE细胞存在能量代谢缺陷、抗氧化应激能力和增殖能力的缺陷。RCS大鼠RPE细胞和小鼠神经干细胞共培养进行线粒体交换后，RCS大鼠RPE细胞的能量代谢、ROS清除及RPE细胞的增殖能力可得到显著改善。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 小鼠神经干细胞与正常RPE细胞TNT的形成及线粒体交换

2．1 引言

2．2 材料和实验方法

2．3 实验结果

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 小鼠神经干细胞与RCS大鼠RPE细胞的线粒体交换及对其RPE细胞功能的影响

3．1 引言

3．2 材料和实验方法

3．3 实验结果

3．4 讨论

3．5 小结

全文结论

参考文献

文献综述 TNT：一种新型细胞交流机制

攻读学位期间发表的论文

致谢