CXCL12对少突胶质前体细胞的促增殖作用及其机制研究

摘要

脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是以造成患者损伤平面以下所支配区域感觉、运动功能及排尿、排便功能异常为主要临床表现的一种高发性、难治性中枢神经系统损伤。随着社会经济和交通运输业的发展，SCI的发生率呈逐年增高趋势，严重影响患者生活质量，由此也给患者、家人、国家带来了严重的社会经济负担。目前对于SCI的研究虽然取得了一些可喜成果，但是在实际的临床工作中，SCI的治疗效果仍不理想，SCI的治疗仍是医学界一个有待攻克的难题。可见，开展SCI的治疗研究是一个急迫且具有科学和社会意义的课题。
　　SCI是一个长期的复杂的损伤过程:既包括受伤当时的直接机械暴力本身对神经细胞、神经胶质细胞、血管等的离断、破坏所引起的原发性损伤，又包括损伤后一段时间内的炎症反应、组织水肿、组织缺氧、组织缺血、脂质过氧化作用、谷氨酸受体过度激活、钙离子超载通路激活等一系列因素导致的继发性级联损伤。SCI在直接导致神经细胞死亡的同时，还可引起少突胶质细胞大量死亡，进而导致轴突脱髓鞘改变，严重影响机体各种神经功能的发挥。
　　少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs)是少突胶质细胞系发育的起始细胞，是还未成熟的少突胶质细胞。一方面，OPCs具较强的增殖能力，能够在体内快速增殖;另一方面，OPCs能在特定信号因子的作用下定向迁移，最终分化为成熟少突胶质细胞，包绕轴突形成髓鞘。已有相关研究结果表明:通过OPCs细胞移植，OPCs能够在体内存活，促进髓鞘形成，最终明显改善SCI大鼠的运动、神经功能。
　　趋化因子除了早期发现的对炎症细胞、骨髓细胞起传统的趋化作用外，现在还发现在胚胎期中枢神经系统的发育，神经损伤后的修复过程中均具有不同程度的作用。在正常生理条件下，中枢神经系统广泛表达CXCL12/CXCR4，起着介导神经元前体细胞向最终功能区域定向迁移的作用。在病理条件下，CXCL12/CXCR4分子更是与神经系统损伤、修复过程密切相关。已有文献报道:CXCL12对脉络膜视网膜血管内皮细胞、肿瘤细胞、神经胶质瘤细胞及其前体细胞、初级小胶质细胞、神经前体细胞等多种细胞增殖、分化等生长均具有一定影响。也有发现CXCL12可以通过影响基质金属蛋白酶3(Matrix Metalloproteinase3，MMP3)and基质金属蛋白酶9(MatrixMetalloproteinase9，MMP9)的表达变化来影响神经前体细胞的增殖和分化。因此，我们有理由推测CXCL12也有可能以类似的作用机制参与由神经前体细胞分化而来的OPCs增殖、分化过程的调控。
　　目的:
　　本实验拟行OPCs的分离纯化，建立其体外培养模型，观察其在体外生长、增殖情况。探索CXCL12对OPCs增殖的影响，并检测CXCR4、CXCR7、MMP9在其中的重要作用，以期更好的了解OPCs增殖、分化特性，为后期研究移植后的OPCs在体内存活、增殖、分化调节，脱髓鞘轴突的再髓鞘化，轴突的再生，最终为脊髓损伤的治疗奠定一定的实验基础。
　　方法:
　　1.选用出生48小时(hour，h)内的SD大鼠，取大脑皮质组织，用振荡分离、差速贴壁等方法分离、纯化、培养获得OPCs。采用免疫细胞化学技术，根据早期OPCs细胞膜上特异性的表达PDGFR-α，行分离获得的OPCs鉴定。将OPCs转入定向分化培养基中继续培养一定时间后，根据OPCs诱导中晚期O4、MBP表达，行少突胶质细胞成熟情况的鉴定。
　　2.体外条件下，用CCK-8法检测OPCs在不同浓度的CXCL12(0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL)培养条件下，在不同时间点(0h、24h、48h、72h)的增殖情况。利用Western blot法检测OPCs在不同浓度的CXCL12作用72h后下游CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达。
　　3.在20ng/mL的CXCL12培养条件下，选用经过筛选后能够有效干扰OPCs的CXCR4、CXCR7表达的CXCR4 siRNA、CXCR7 siRNA分别干扰CXCR4、CXCR7蛋白表达。用CCK-8检测各实验组(CXCL12、CXCL12+con siRNA、CXCL12+CXCR4siRNA、CXCL12+CXCR7 siRNA) OPCs在不同时间点(0h、24h、48h、72h)的增殖情况，用Western blot法检测OPCs各实验组条件下作用72h后CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达情况。
　　4.利用经过筛选后能够有效干扰CXCR4、CXCR7下游的MMP9表达的MMP9siRNA干扰MMP9表达，然后CCK-8检测在20ng/mL的CXCL12条件下OPCs在各时间点(0h、24h、48h、72h)的增殖情况。
　　结果:
　　1.在原代培养第9-10天，细胞呈明显分层生长态势，利用振荡分离、差速贴壁方法获得了大量高纯度的OPCs。刚开始细胞胞体较小，直径6～10μm，近似的呈圆形，为折光性较强的小亮点，有的胞体开始有细小的两极细胞突起或者三极细胞突起出现。免疫细胞化学检测结果显示:分离后OPCs能特异性表达PDGFR-α，定向分化培养后，OPCs趋于成熟，周围纤细突起较未诱导前稍增多，细胞胞体增大，诱导中期O4表达呈阳性，诱导晚期胞体网状纤细突起更加明显，呈“树枝状”甚至“蜘蛛网状”分布，MBP表达呈阳性，是成熟的髓鞘形成细胞。
　　2.在一定浓度范围内，随着培养基中CXCL12浓度增加，OPCs增殖作用逐渐增强，CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达量逐渐增加;在一定范围的培养时间内，随着培养时间的延长，OPCs增殖逐渐增强，CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白的表达量逐渐增加。与0ng/mL相比，20ng/mLCXCL12作用72h后，OPCs增殖及CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达增加最明显(P＜0.05)。
　　3.用CXCR4siRNA、CXCR7siRNA分别干扰CXCR4、CXCR7蛋白表达后，OPCs在各时间点的增殖均逐渐受到抑制，培养72h后差异最显著(P＜0.05、P＜0.05)，CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达量逐渐减少，培养72h后差异最显著(P＜0.05、P＜0.01)。
　　4.单独用MMP9 siRNA干扰MMP9表达后，OPCs增殖同样受到抑制，增殖作用降低(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.本实验通过振荡分离、差速贴壁法分离获得了实验所需的原代OPCs，在体外培养条件下可以继续存活，分化成熟。
　　2.在一定的浓度和时间范围内，CXCL12能够明显促进OPCs的增殖，这种促增殖作用与CXCR4、CXCR7、MMP9蛋白表达上调密切相关。

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

第二章 少突胶质前体细胞的分离、原代培养、鉴定

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 CXCL12对少突胶质前体细胞增殖的影响及其可能机制的研究

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

全文结论

参考文献

文献综述 少突细胞前体细胞在脊髓损伤中作用的研究进展

攻读学位期间发表的论文

致谢