卡马拉素抑制肾上腺皮质癌的实验研究

摘要

背景：
　　肾上腺皮质癌(adrenocortical cacinoma，ACC)是一种起源于肾上腺皮质的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的0.01％-0.02％。虽发病率低，但ACC恶性程度高，侵袭性强，起病隐匿，预后差，大多数患者在发现肿瘤时已出现局部浸润和远处转移，五年平均生存率低于30％，其治疗仍以根治手术为主，但对于转移及进展型ACC缺乏有效的药物治疗手段。现有的以米托坦为核心药物的化疗方案存在有效率低毒副作用大的缺点。因此，对ACC新药物的研究变得尤为重要。卡马拉素(rottlerin)是一种提取自楸树的植物多酚，印度传统医学将其当做抗绦虫药物。最新研究表明，卡马拉素具有抗肿瘤活性，这种抗肿瘤作用是通过多通路多机制来实现的，其中包括对Wnt/β-catenin通路的抑制。而Wnt/β-catenin通路与ACC的发生发展密切相关。本研究尝试在体外细胞实验和动物实验中证明卡玛拉素对ACC皆具有抗肿瘤活性，并初步探讨其可能的抗肿瘤机制，以为ACC的治疗提供更有效更安全的化疗药物。
　　材料和方法：
　　1.体外实验
　　用CCK-8实验验证卡马拉素对ACC细胞株（(NCI-H295R和SW-13)的增殖具有——抑制作用，且这种抑制作用具有时间和剂量依赖的特点。AnnexinⅤ-PI染色法及AO/EB染色法证明卡马拉素可促进ACC细胞株的凋亡，且浓度越高，凋亡促进作用越强。流式细胞仪分析卡马拉素对ACC细胞周期的影响。TRANSWELL实验及细胞划痕实验证明卡马拉素对ACC细胞的迁移和侵袭作用具有抑制作用。WB实验证实rottlerin可抑制ACC细胞中Wnt/β-catenin通路关键蛋白β-catenin、LRP6及p-LRP6的表达。
　　2.动物实验
　　20只（性别不限）4周龄BALB/C nu/nu裸鼠皮下注射SW-13细胞构筑ACC移植瘤模型，待移植瘤长径增长至约4mm时将裸鼠随机分为4组（对照组、DMSO组、Rottlerin4 mg/kg组以及Rottlerin2 mg/kg组，每组5只），每日予以腹腔注射，持续4周，每日1次，对照组注射0.5ml生理盐水/只/日，DMSO组注射0.45ml+0.05mlDMSO/只/日，Rottlerin4 mg/kg组及Rottlerin2 mg/k g组按照裸鼠体重给予卡马拉素溶液注射。每4天测量1次裸鼠移植瘤大小并监测裸鼠体重。4周后处死裸鼠，剥离移植瘤，制成石蜡切片，予以HE染色，观察成瘤情况，用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick endlabeling，TUNEL)实验检测卡马拉素在移植瘤细胞的凋亡情况。并对各组的肿瘤切片进行β-catenin、LRP6及p-LRP6的免疫组化染色，验证卡马拉素可在体内抑制ACC细胞中Wnt/β-catenin通路关键蛋白β-catenin、LRP6及p-LRP6的表达。
　　结果：
　　1.卡马拉素可在体外抑制ACC细胞的增殖，且这种抑制作用具有时间依赖性和剂量依赖性，48h IC50分别为NCI-H295R:5.02μM、SW-13:4.87μM。卡马拉素在体外可促进ACC细胞的凋亡，经2.5μM卡马拉素处理48小时后，NCI-H295R和SW-13细胞的凋亡率达到13.0％和10.9％，这一比例在5μM组中为43.3％和38.3％，显著高于正常对照组。AO/EB实验结果不但验证了这一结论，也从形态学上证明卡马拉素可促进ACC细胞的凋亡。
　　2.经5μM卡马拉素处理48小时的ACC细胞发生明显的G0/G1期阻滞，G1期细胞比例分别为NCI-H295R:85.14％、SW-13:81.88％，显著高于对照组(p＜0.05)。TRANSWELL实验和细胞划痕实验证实经5μM处理24h后ACC细胞的迁移能力明显下降，迁移细胞数以及迁移率显著低于对照组(p＜0.05)。
　　3.WB实验证实卡马拉素可在体外抑制ACC细胞中β-catenin、LRP6及p-LRP6的表达。在经过2.5μM，5μM，10μM卡马拉素处理48小时后这3种蛋白的表达量与对照组相比明显下降，且随着药物浓度的升高，抑制作用越明显。
　　4.Rottlerin可抑制裸鼠ACC移植瘤的生长。经腹腔注射药物4周后，4个组的裸鼠皆存活，未观察到明显毒副反应，且体重无显著差异。肿瘤平均大小分别为:对照组3.23 cm3，DMSO组3.35 cm3，rottlerin4 mg/kg组1.56 cm3，rottlerin4 mg/kg组1.94 cm3。TUNEL实验结果提示卡马拉素可以促进ACC细胞的凋亡，在TUNEL法染色的肿瘤切片中，注射卡马拉素的裸鼠肿瘤切片中凋亡细胞数量显著多于对照组及DMSO组(p＜0.05)，且rottlerin4 mg/kg组裸鼠肿瘤切片中凋亡细胞数量显著多于rottlerin2mg/kg组(p＜0.05)。免疫组化染色结果提示在rottlerin4 mg/kg组及rottlerin2mg/kg组中β-catenin、LRP6及p-LRP6的表达量较对照组和DMSO组显著下降(p＜0.05)，且rottlerin4 mg/kg组中β-catenin、LRP6及p-LRP6的表达量显著低于rottlerin2 mg/kg组(p＜0.05)。
　　结论：
　　卡马拉素在体外细胞实验中能够抑制ACC细胞的增殖，凋亡，使其发生细胞G0/G1期阻滞，抑制ACC细胞的迁移及侵袭能力，在动物实验中，腹腔注射卡马拉素4周的裸鼠未出现明显毒副作用，卡马拉素可抑制裸鼠ACC移植瘤的生长，且促进移植瘤细胞的凋亡。体外细胞WB实验及动物实验肿瘤切片免疫组化皆提示卡马拉素可抑制Wnt/β-catenin通路关键蛋白β-catenin、LRP6及p-LRP6的表达。这些结果提示卡马拉素对ACC具有抗肿瘤作用，这一作用可能是通过抑制Wnt/β-catenin通路来实现的。因为卡马拉素有在人类中使用的历史，且未见毒副反应的报道，且本研究又验证了其在裸鼠中未见明显毒副反应，故卡马拉素因为其低毒副作用和较高的抗肿瘤活性而成为ACC新的抗肿瘤药物。

目录

声明

英文缩写一览表

摘要

第一章 前言

第二章 卡马拉素对ACC细胞抑制的体外研究

2．1 ACC细胞的复苏、培养、传代

2．1．1 材料与方法

2．1．2 结果

2．1．3 小结

2．2 不同浓度卡马拉素对ACC细胞增殖的影响

2．2．1 材料与方法

2．2．2 结果

2．2．3 小结

2．3 卡马拉素对ACC细胞周期的影响

2．3．1 材料与方法

2．3．2 结果

2．3．3 小结

2．4 卡马拉素对ACC细胞凋亡的影响(annexin-V／PI染色法)

2．4．1 材料与方法

2．4．2 结果

2．4．3 小结

2．5 卡马拉素对ACC细胞凋亡的影响(AO／EB染色法)

2．5．1 材料与方法

2．5．2 结果

2．5．3 讨论

2．6 卡马拉素对ACC细胞侵袭及迁移能力的影响(Transwell实验)

2．6．1 材料与方法

2．6．2 结果

2．6．3 小结

2．7．1 材料与方法

2．7．2 结果

2．7．3 小结

2．8 讨论

第三章 卡马拉素抑制ACC细胞的体内研究

3．1 裸鼠ACC皮下移植瘤模型的建立

3．1．1 材料与方法

3．1．2 结果

3．1．3 小结

3．2 卡马拉素抑制ACC移植瘤的生长

3．2．1 材料与方法

3．2．2 结果

3．2．3 小结

3．3 卡马拉素可在体内促进ACC细胞的凋亡

3．3．1 材料与方法

3．3．2 结果

3．3．3 小结

3．4 讨论

第四章 卡马拉素抑制ACC细胞Wnt／β-catenin通路

4．1．1 材料与方法

4．1．2 结果

4．1．3 小结

4．2 卡马拉素在体内抑制ACC细胞Wnt／β-catenin通路

4．2．1 材料与方法

4．2．2 结果

4．2．3 小结

4．3 讨论

全文讨论

参考文献

文献综述一 肾上腺皮质癌分子病理学研究进展

文献综述二 卡马拉素——一种新型的抗肿瘤药物

攻读博士学位期间发表的论文

致谢