替罗非班通过激活PI3K/Akt/eNOS通路诱导内皮依赖的NO-cGMP信号在冠状动脉舒张中的作用

摘要

冠心病(coronary heart disease，CHD)，也被称为缺血性心脏病(ischimic heart disease，IHD)，其死亡率在我国人群死因中仅仅位于卒中之后“屈居”第二，因此对冠心病的防治是中国公共卫生事业所面临的极其严峻的挑战。
　　急性冠脉综合征(Acute Coronary Syndrome，ACS)是一组由于冠状动脉血流突然减少而引起急性心肌缺血和/或梗死的临床综合征，其可分为非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)、ST段抬高型心肌梗死(STEMI)与不稳定型心绞痛(UA)，是冠心病的表现形式之一。作为心肌有效再灌注治疗的方式之一，经皮冠脉介入治疗(PercutaneousCoronary Intervention，PCI)得到了广泛的临床应用。但在ACS患者经PCI冠脉再通后，尽管去除了主要由微血管阻塞引起的大的心肌层冠状动脉的闭塞后，心肌依然出现无法再灌注的区域，此现象被定义为无/慢复流现象，无复流的出现常预示着不良预后。在无复流的治疗策略的探索中，研究者们发现，替罗非班可作为初次PCI患者的独立预测因子。
　　替罗非班（tirofiban）作为新一代的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受体拮抗剂，在抗凝、抗血小板治疗中有重要作用，广泛应用于PCI患者术前抗凝。近期的研究发现，替罗非班能够通过改善PCI患者的内皮功能障碍和恢复损伤的一氧化氮(nitric oxide，NO)活性，改善外周动脉血流。那么替罗非班是否能够直接促进NO合成，改善冠脉供血呢？NO作为经典的血管舒张因子已然得到了巨大的关注和研究，其在人体中有内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，神经型一氧化氮合酶(nNOS)，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)三种类型，均可产生NO。在替罗非班的作用中，哪种类型的NOS发挥了更为重要的作用？调控NOS的众多信号通路，特别是已经得到广泛证明的PI3K/Akt通路在其中又扮演了什么角色呢？作为NO的主要受体，sGC可受其活化，然后催化cGTP合成cGMP。cGMP是细胞信号转导系统中重要的第二信使，可使细胞间的信号传递到细胞内。cGMP又可通过PKG调控冠脉平滑肌表达的众多阴阳离子通道，特别是BKCa，SKCa和KATP三种离子通道从而发挥调节冠脉舒张功能的作用。那么在替罗非班的作用中，各个类型的钾离子通道又具有什么样的地位呢？
　　基于上述结果，我们推测:替罗非班可能是通过PI3K/Akt通路调节冠脉内皮NOS功能，诱导其产生NO，通过NO/cGMP信号传导及其下游钾离子通道，改善冠脉舒张，缓解无复流现象。该问题的解决有望初步阐明替罗非班治疗无复流的分子机制，为以后探讨无复流的治疗提供基础研究基础。
　　本课题分四个部分进行研究:
　　第一部分:替罗非班对大鼠离体冠状动脉的影响
　　目的：
　　1、观察替罗非班对大鼠离体冠状动脉血管功能的影响。
　　2、研究替罗非班对冠脉的舒张作用及与内皮的关系。
　　内容：
　　1、分离制备Wistar大鼠离体冠状动脉，将制备的大鼠离体冠状动脉血管环，固定于微血管张力测定仪上，建立Wistar大鼠离体冠状动脉功能检测平台，对离体冠脉进行血管标准化处理与功能检测以确定血管、内皮功能符合实验要求，记录下血管环在5-HT(10-6M)刺激下达到最大的收缩程度。
　　2、在内皮存在的情况下，调节血管环张力使其达到最佳状态，之后加入5-HT(10-6M)处理使血管环达最大收缩状态，平衡30min，再采用累积给药法加入替罗非班，观察不同浓度的替罗非班(10-7-10-5M)对血管环收缩舒张功能的影响，通过计算机血管张力信息采集系统记录下血管张力变化。
　　3、使用直径适宜的头发丝在血管环内小心往复拉伸摩擦以去除其内皮，通过内皮完整性检测后，5-HT预处理使血管环达最大收缩状态，同样平衡30min后，累积加入替罗非班(10-7-10-5M)，观察其对血管环的收缩舒张功能的影响，记录下血管张力变化。
　　结果：
　　1、一定浓度(10-7-10-5M)替罗非班对5-HT预处理收缩的大鼠离体冠脉具有舒张作用，该作用随浓度升高而增强，并且在10-5M达最大舒张程度51.5±8.9％。
　　2、去除内皮后，替罗非班对5-HT预处理收缩的大鼠离体冠脉的舒张作用为大幅下降，在10-5M最大舒张程度为12.3±2.6％。
　　第二部分:替罗非班通过增加内皮细胞NO产量而诱导冠状动脉舒张功能
　　目的：
　　1、探究替罗非班对HUVECs细胞产生NO含量的影响
　　2、观察不同NOS抑制剂在替罗非班舒张冠脉作用中的影响
　　3、探究替罗非班对HUVEC细胞eNOS磷酸化表达的影响
　　方法：
　　1、常规培养HUVEC细胞，给予不同浓度替罗非班（10-7，10-6，10-5M）处理传入6孔板内的HUVEC细胞不同时间(5、10、15、30、45min)后，收集培养基，用NO检测试剂盒检测各实验组NO含量变化。
　　2、血管环通过标准化处理与内皮完整性检测后，5-HT预处理使血管环达最大收缩状态，平衡30min后，每组血管环加入不同的NOS抑制剂，包括eNOS特异性抑制剂L-NAME(10-4 M)，iNOS特异性抑制剂SMT（10-5M），以及总NOS抑制剂L-NMMA(10-5M)，平衡30min，然后再累积加入替罗非班，观察替罗非班(10-7-10-5M)在不同NOS抑制剂预处理的情况下对血管舒张收缩功能的影响。
　　3、收集不同时间替罗非班处理好的HUVEC细胞，提取蛋白，采用蛋白免疫印记法检测其磷酸化eNOS、eNOS的蛋白表达情况。
　　结果：
　　1、替罗非班对HUVEC细胞NO产量的影响与其浓度和处理时间相关，替罗非班处理可显著增加HUVECs细胞NO产生量。
　　2、通过不同的NOS抑制剂(L-NMMA10-5M，SMT10-5M，L-NAME10-4M)观察大鼠离体血管对替罗非班的反应，发现eNOS阻断剂L-NAME与总NOS抑制剂L-NMMA可阻断替罗非班的舒张血管作用。
　　3、替罗非班(c=10-5M)处理可增加HUVEC细胞磷酸化-eNOS的表达。
　　第三部分:替罗非班通过影响PI3K/Akt通路而诱导冠状动脉舒张功能
　　目的：
　　1、明确替罗非班对HUVECs细胞Akt、磷酸化Akt蛋白表达量的影响。
　　2、通过使用PI3K/Akt信号通路的抑制剂来探究替罗非班对HUVECs细胞eNOS、磷酸化eNOS蛋白表达量的影响
　　方法：
　　1、收集替罗非班处理好的HUVEC细胞，提取蛋白，采用蛋白免疫印记法检测其磷酸化Akt、Akt的蛋白表达情况。
　　2、使用PI3K抑制剂wortmannin、LY294002、预处理HUVEC细胞，常规提取各实验组总蛋白，用Western-Blot方法检测其磷酸化Akt、Akt、磷酸化eNOS、eNOS表达变化;用NO检测试剂盒检测各实验组NO含量变化。
　　3、使用Akt抑制剂SH-5预处理HUVEC细胞，用Western-Blot方法检测磷酸化eNOS、eNOS的表达变化。
　　结果：
　　1、替罗非班对HUVEC细胞磷酸化Akt、Akt蛋白表达的影响与其处理时间相关，一定时间(t=10min)的替罗非班处理可显著增加HUVECs细胞p-Akt蛋白的表达。
　　2、使用PI3K抑制剂wortmannin(10-7M)、LY294002(5×10-5M)预处理HUVEC细胞，再加入替罗非班(10-5M)发现磷酸化eNOS表达相比于单独替罗非班处理，均有所下降;同时NO产量也相应的比替罗非班单独处理也有所下降。
　　3、使用Akt抑制剂SH-5(10-5M)预处理HUVEC细胞，再加入替罗非班(10-5M)发现磷酸化eNOS表达相比于单独替罗非班处理有所下降。
　　第四部分:替罗非班通过cGMP以及钾离子通道诱导离体大鼠冠状动脉舒张
　　目的：
　　1、探究替罗非班对大鼠离体冠状动脉cGMP含量的影响。
　　2、通过应用sGC抑制剂ODQ来抑制大鼠离体冠脉产生cGMP，观察替罗非班对大鼠离体冠脉的影响。
　　3、探讨不同类型钾离子通道在替罗非班对大鼠离体冠状动脉舒张功能的影响，观察替罗非班在不同钾通道抑制剂的作用下其对离体冠状动脉血管功能的影响。
　　方法：
　　1、将各实验组进行不同处理的离体冠状动脉提取蛋白后使用cGMP ELISA试剂盒分析检测各实验组cGMP含量变化。
　　2、在内皮存在的情况下，调节血管环张力使其达到最佳状态，之后加入5-HT(10-6M)处理使血管环达最大收缩状态，平衡30min后加入ODQ(10-5M)，再平衡30min，同样采用累积给药法加入替罗非班，观察不同浓度的替罗非班(10-7-10-5M)对血管环收缩舒张功能的影响，通过计算机血管张力信息采集系统记录下血管张力变化。
　　3、血管环通过标准化处理与内皮完整性检测后，5-HT预处理使血管环达最大收缩状态，平衡30min后，每组血管环加入不同的钾离子通道抑制剂，分别为BKCa通道抑制剂蝎毒素(10-7M)、SKCa通道抑制剂蜂毒素(10-7M)、KATP通道抑制剂格列苯脲(10-5M)，平衡30min，然后再累积加入替罗非班，观察替罗非班（10-7-10-5M）在不同钾离子通道抑制剂预处理的情况下对血管舒张功能的影响。
　　结果：
　　1、替罗非班对血管环cGMP含量的作用受内皮影响，内皮完整性良好时，替罗非班可促进大鼠离体冠状动脉cGMP的表达量，当去除内皮后，替罗非班对血管环cGMP的影响甚微。
　　2、sGC阻断剂ODQ(10-5M)可显著抑制替罗非班的舒张血管作用，加入ODQ后，替罗非班对5-HT预处理收缩的大鼠离体冠脉具有舒张作用从51.3±7.4％降为13.6±3.8％。
　　3、BKCa通道抑制剂蝎毒素(10-7M)对替罗非班舒张冠脉血管环的作用具有明显抑制作用。
　　全文结论：替罗非班可诱导PI3K/Akt通路蛋白的磷酸化，进而促进eNOS合成NO，从而活化下游的sGC，促进其催化产生cGMP，并进一步通过调节下游大电导钙激活钾通道(BKCa)发挥舒张冠状动脉血管作用。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

第一部分 替罗非班对大鼠离体冠状动脉的影响

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第二部分 替罗非班通过增加内皮细胞NO产量而诱导冠状动脉舒张功能

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

第三部分 替罗非班通过影响PI3K／Akt通路增加内皮NO释放来诱导冠状动脉舒张功能

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

4．4 小结

第四部分 替罗非班通过cGMP以及钾离子通道诱导离体大鼠冠状动脉舒张

5．1 材料与方法

5．2 结果

5．3 讨论

5．4 小结

全文总结

参考文献

文献综述一 无复流现象的研究进展

文献综述二 糖蛋白Ⅱb／Ⅲa抑制剂在疾病中的治疗应用

攻读博士期间发表论文情况

致谢