BMP-2/Smad调控PMVECs肌样分化在HPS肺微血管异常扩张中的作用和机制研究

摘要

背景和目的：
　　肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是一种慢性肝病的晚期并发症，主要临床症状为难治性低氧血症。据临床资料统计，肝肺综合征在肝硬化患者中发病率为4-29％。目前，HPS的发病机制研究已取得一定的成果，但仍然未完全阐明，且临床转化治疗还需进一步开展。其中，血管异常扩张、动静脉分流、氧合功能障碍是HPS的主要病理表现，这些变化通常引起肺血管重建，从而加速肺部病理的恶化进程。肺微血管异常扩张的病理机制是HPS中的研究热点，在我们团队的前期研究中发现，血管的异常扩张可能与肺微血管内皮细胞(pulmonary microvascular endothelial cells，PMVECs)的异常增殖有关，而在另一方面，我们发现HPS病人在进行肝移植手术后，肺微血管阻力明显升高，表明肺微血管存在收缩反应，而在正常情况下，肺微血管是不具备这一特性的，血管的异常扩张无法完全用PMVECs的异常增殖来进行解释，因此可能存在其他的病理机制。在前期实验，采用HPS大鼠血清对PMVECs进行刺激培养，随后发现PMVECs中肌性相关蛋白SM-α-actin、calponin、SM-MHC的表达水平显著上调，这些结果提示PMVECs在HPS血清病理条件下发生了肌样分化，因此具有收缩特性。在先前的研究报道中，骨形态发生蛋白2(Bone morphogenic protein-2，BMP-2)在细胞的增殖、分化及迁移中起重要调节作用，但是其在PMVECs肌样分化中的作用还不太明确。因此本研究拟证实HPS血清通过上调BMP-2/Smad信号通路引起PMVECs发生肌样分化。
　　方法：
　　1.构建HPS大鼠模型并制备血清，培养大鼠原代PMVECs;检测HPS大鼠血清对PMVECs肌样分化的影响
　　本课题的HPS大鼠模型采用胆总管结扎法(chronic bile duct ligation，CBDL)进行构建，模型构建28天之后，采集动脉血进行血气分析，随后取肺组织和肝组织进行HE染色，最后收集并制备正常血清和HPS血清备用。采用组织块法培养原代PMVECs，组织化学法进行内皮细胞特异性抗原鉴定。将第3代PMVECs在含5％HPS血清的内皮培养基中培养0h、24h、48h和72h后，观察PMVECs形态的变化情况，同时检测肌性相关蛋白SM-a-actin，caplonin，SM-MHC的表达变化。
　　2.检测HPS大鼠血清对PMVECs中BMP-2/Smad信号通路的影响
　　将PMVECs分为正常血清组（C组）和HPS血清组(HPS组)，分别采用含5％正常血清或5％HPS血清的DMEM培养基培养PMVECs24h、48h和72h，各个时间点后采用RT-PCR和western blot检测各组PMVECs中BMP-2转录水平和蛋白表达水平。同时采用western blot检测各组不同时间点PMVECs中BMP-2下游关键蛋白Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平。
　　3.检测人重组蛋白Noggin对HPS血清介导PMVECs肌样分化的影响。
　　采用BMP-2抑制剂人重组蛋白Noggin预处理，检测在不同血清刺激培养72h后，PMVECs中Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平的变化。并检测肌性相关蛋白SM-a-actin，caplonin，SM-MHC表达的变化。
　　4.检测Smurf-1依耐性Smad1/5蛋白降解对HPS血清调控PMVECs中BMP-2/Smad通路活性的影响
　　将PMVECs分为正常血清组（C组）和HPS血清组(HPS组)，分别采用含5％正常血清或5％HPS血清的DMEM培养基培养PMVECs24h、48h和72h，各个时间点后采用western blot检测各组PMVECs中Smurf-1蛋白表达变化。之后，采用siRNA下调PMVECs中Smurf-1的表达水平，分别检测不同血清刺激培养72h后，PMVECs中Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平的变化。并进一步采用蛋白酶体抑制剂MG132处理PMVECs后，分别检测在不同血清刺激培养72h后，PMVECs中Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平的变化。
　　结果：
　　1.HPS大鼠血清促进PMVECs的肌样分化
　　在倒置显微镜下观察:C组培养PMVECs多呈现为梭形。而HPS组培养PMVECs多呈现为呈长梭形，与C组形态相差巨大。在HPS血清刺激之前，PMVECs内未检测SM-α-actin、calponin、SM-MHC等蛋白表达，而HPS血清刺激24h、48h、72h后，PMVECs内SM-α-actin、calponin、SM-MHC蛋白表达增加(P＜0.05)，呈时间依耐性。
　　2.HPS大鼠血清激活PMVECs中BMP-2/Smad信号通路
　　相比C组，HPS组PMVECs内BMP-2mRNA及其蛋白表达显著增加(P＜0.05)，呈时间依耐性;同时，BMP-2下游关键分子Smad1/5及P-Smad1/5蛋白水平显著增加(P＜0.05)，呈时间依耐性;
　　3.人重组蛋白Noggin部分抑制HPS血清介导PMVECs肌样分化的进程
　　人重组蛋白Noggin能显著抑制HPS血清介导BMP-2/Smad信号通路的活化，并抑制PMVECs中肌性蛋白SM-α-actin、calponin的表达(P＜0.05)，但对SM-MHC的表达没有影响(P＞0.05)。
　　4.HPS血清抑制Smurf-1介导的Smad1/5降解，促进BMP-2/Smad信号通路的过度激活
　　相比C组中各时间点，HPS组PMVECs内Smurf-1蛋白表达显著下降(P＜0.05)，呈时间依耐性;在HPS血清刺激下，siRNA-Smurf-1和MG132能进一步抑制PMVECs内Smad1/5的降解，促进BMP-2/Smad的活化。
　　结论：
　　本研究表明HPS大鼠血清诱导的PMVECs内BMP-2及其mRNA表达增强，而其下游的Smad1/5异常激活与HPS血清诱导的Smurf-1下调有关。采用人重组蛋白Noggin抑制BMP-2/Smad的活化，能部分逆转PMVECs的肌样分化进程.

目录

声明

缩略语表

摘要

第一章 前言

1．1 选题缘由

1．2 研究背景

1．3 研究内容

1．4 研究方法

第二章 肝肺综合征大鼠血清对PMVECs肌样分化的作用研究

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

第三章 BMP-2／Smad通路在HPS大鼠血清诱导PMVECs肌样分化中的作用研究

3．1 材料和方法

3．2 结果

3．3 讨论

第四章 Smurf-1介导的Smad蛋白降解在PMVECs肌样分化中的作用研究

4．1 材料与方法

4．2 结果

4．3 讨论

第五章 (拓展研究)COX-2介导的BMP信号通路在肝肺综合征单核细胞肺聚集中的作用

5．1 拓展研究的目的

5．2 拓展研究的方法

5．3 拓展研究的结果

5．4 拓展研究的结论

第六章 (拓展研究，在法国图卢兹第三大学LBCMCP研究所完成)Myosin在PMVECs群体迁移中的作用和机制研究

6．1 拓展研究的目的

6．2 拓展研究的方法

6．3 拓展研究的结果

6．4 拓展研究的结论

全文总结

参考文献

文献综述 内皮祖细胞在肺血管重建中作用的研究现状

攻读学位期间的研究成果

致谢