场强化辅助多相体系萃取分离鬼箭羽中有效成分的研究

摘要

鬼箭羽（Euonymus alatus）（又称为卫矛）隶属于卫矛科卫矛属植物卫矛，作为传统中药在中国已应用了两千多年。根据现代药理的相关研究表明，鬼箭羽具有降血糖、降血压和抗肿瘤等活性。鬼箭羽中主要含有黄酮和酚酸等有效成分，对于此类活性成分以前多采用加热回流萃取、冷浸萃取等方法进行萃取，但这些传统的萃取分离方式需要使用较多的有机溶剂，而且萃取效率低。本文系统地研究了在不同温度下不同分子量的聚乙二醇（PEG）对双水相组成的影响及其相变化规律，绘制相图、拟合实验数据并对相平衡数据进行关联。利用体系浊点和分相特征，基于有效成分的化学性质，结合外加超声和微波场的强化辅助作用，分别在均匀和分相状态下萃取鬼箭羽中有效成分，旨在建立简单、快速、高效的样品前处理方法，采用光谱和色谱分析方法对其进行定量分析，研究的主要内容和结果如下：
　　1、采用UPLC-QTOF-MS对鬼箭羽萃取液中的黄酮和酚酸类化合物进行分析鉴定，通过其一级、二级质谱和紫外光谱的分析，并对其裂解途径进行推断，最后通过与对照品进行验证，已确定萃取液中含有儿茶素、二氢杨梅素两种黄酮化合物和两种酚酸类化合物即没食子酸和鞣花酸，它们是鬼箭羽中主要有效化学成分。
　　2、采用反相液相色谱法和紫外分光光度法，建立了鬼箭羽中黄酮和酚酸类成分儿茶素、二氢杨梅素、没食子酸和鞣花酸的HPLC和UV分析方法。以乙腈-0.5％磷酸为流动相，在280nm处进行检测，其分离度良好，儿茶素和二氢杨梅素的保留时间分别为19.09min和26.64min，分别在0.8992-56.20mg·L-1和1.004-50.20mg·L-1范围内呈现良好的线性关系，其回收率在99.5-101.5%之间，其RSD分别为1.17%和1.24%；而没食子酸和鞣花酸保留时间为6.21min和32.79min，分别在0.9200-46.00mg·L-1和0.8580-42.90mg·L-1范围内呈现良好的线性关系，其回收率在99.0-101.2%之间，其RSD分别为0.79%和0.96%。以芦丁作为对照品，采用盐酸-镁粉法建立鬼箭羽总黄酮含量的测定。鬼箭羽中总黄酮在0.1024-1.024mg·mL-1范围内呈良好的线性关系，回收率在99.76-101.4%之间，其RSD值为0.98%。对于鬼箭羽中总酚酸的含量测定采用不显色直接测定法，以没食子酸作为对照品，在281nm处对总酚酸进行检测，建立了总酚酸的紫外测定方法。鬼箭羽中总酚酸在0.92-18.4mg·mL-1范围内呈良好的线性关系，回收率在99.50-100.7%之间，其RSD值为0.50%，将此方法用于鬼箭羽中黄酮和酚酸类化合物的测定，方法可靠。
　　3、对PEG-(NH4)2SO4双水相相平衡的性质及其相关数据的测定。用浊点法测定了PEG-(NH4)2SO4双水相体系的相图，考察了PEG分子量和温度对相平衡的影响情况，采用Merc huk经验方程对其双节线数据进行拟合；而其相平衡数据的关联则用经验方程Othmer-Tobias和Bancrof经验方程。实验结果表明，PEG成相能力随着其分子量的变化顺序分别为：PEG-6000＞PEG-4000＞PEG-2000＞PEG-1000＞PEG-400。PEG-(NH4)2SO4双水相体系两相区随着温度的升高其成相能力增强，即双节线更靠近原点。各个实验数据拟合的相关系数都大于0.99，说明方程关联效果良好，为后续的试验提供了理论基础。
　　4、采用超声辅助回流萃取技术，通过不同分子量PEG筛选，以PEG-400水溶液作为萃取溶剂，利用单因素试验结合响应面分析研究了鬼箭羽中黄酮化合物的萃取条件，并通过温度诱导浊点分相萃取，进一步研究了目标萃取物萃取富集分离效果。超声辅助萃取的优化条件为：PEG-400浓度15%（w/w），药材颗粒度80目，液料比60:1，萃取时间10min。经验证在优化条件下总黄酮、儿茶素和二氢杨梅素平均收率分别为3.126、0.657和1.353mg/g。在所得到的萃取液中通过加入5.6g(NH4)2SO4，控制平衡温度为75℃，pH为3.5可诱导浊点分相萃取黄酮化合物，在上相的富PEG-400相中目标萃取物富集效果良好，富集倍数均能达到5倍以上。与乙醇作为溶剂相比，PEG-400水溶液作为萃取溶剂具有较好的萃取选择性；通过不同萃取方法的比较，超声场可辅助强化萃取过程，提高萃取效率。
　　5、采用微波辅助萃取技术，以PEG-400-(NH4)2SO4双水相体系作为萃取溶剂，利用单因素试验结合响应面的Box-Behnke n设计分析优化了鬼箭羽中酚酸化合物的萃取条件。微波辅助-双水相萃取的最佳萃取条件为：最佳萃取条件为双水相组成为18%（w/w）(NH4)2SO4和26%（w/w）PEG-400，萃取温度为95℃，液料比为60:1，经验证在优化条件下没食子酸和鞣花酸的收率分别为0.4525和0.1517mg/g，与预测值接近。通过不同萃取方法的比较，表明微波场的作用可强化萃取过程，提高萃取效率。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 鬼箭羽概述

1.2 鬼箭羽中的有效成分

1.3 鬼箭羽的药理活性

1.4 中药有效成分现代提取新技术

1.5 双水相萃取技术的研究

1.6 浊点萃取技术的研究

1.7 本课题的主要研究内容与意义

参考文献

第二章 UPLC-QTOF-MS分析鬼箭羽中的化学成分

2.1 前言

2.2 仪器与试剂

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5本章小结

参考文献

第三章 鬼箭羽中有效成分的含量测定

3.1 前言

3.2 仪器及试剂

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5本章小结

参考文献

第四章 PEG-(NH4)2S O4双水相体系相图的绘制与拟合

4.1 前言

4.2 仪器与试剂

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

参考文献

第五章 超声辅助回流萃取-温度诱导浊点萃取鬼箭羽中黄酮化合物

5.1 前言

5.2 仪器及试剂

5.3 实验方法

5.4 结果与讨论

5.5 本章小结

参考文献

第六章 微波辅助-双水相萃取鬼箭羽中酚酸化合物

6.1 前言

6.2 仪器及试剂

6.3 实验方法

6.4 结果与讨论

6.5 小结

参考文献

附录攻读学位期间发表的论文

致谢