盐芥谷胱甘肽过氧化物酶基因家族响应逆境的功能研究

摘要

长期以来，干旱、高盐、重金属等非生物胁迫一直是制约植物生长的重要因素。因此，深入研究植物的抗逆特性及其机理，对于进一步进行转基因研究、增强植物抗逆性、改良植物生长状况具有十分重要的现实意义。谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione Peroxidases，GPXs)则是植物体内清除活性氧、保护生物膜、抵御逆境胁迫的重要酶类之一。植物中GPXs的研究起步较晚，而将GPXs整个家族作为研究对象更鲜有报道。本实验室已经以抗逆模式植物盐芥为材料，对盐芥GPXs(TsGPXs)进行了相关研究，如克隆得到TsGPXs的8个成员的基因序列、基因序列的生物信息学分析、蛋白质组学分析等。 基于本实验室已有的研究成果，为了进一步探究盐芥中GPXs在应答逆境胁迫中的作用特点，本研究对TsGPXs与其他物种已有GPXs序列进行了系统进化树分析;分别从生理生化、基因表达和蛋白表达水平上研究了盐芥不同组织在应答高盐和干旱胁迫下GPXs的表达特点。在上述研究基础上，选取了有意义的家族成员进行的融合蛋白表达分析和亚细胞定位分析探索。获得的结论如下: 1.为了了解TsGPXs各成员与其他植物中GPXs的蛋白序列在结构上的同源性，采用生物信息学方法进行了系统进化树分析。结果表明TsGPX1与TsGPX7、TsGPX2和TsGPX3、TsGPX4和TsGPX5同源性最高，但分属三个进化枝，而TsGPX6和TsGPX8各自位于不同的进化枝上。这一聚类结果与亚细胞定位预测结果较为吻合。总体上盐芥TsGPXs各成员与拟南芥AtGPXs各成员同源性最强，可见在进化过程中，同一物种不同家族成员有着各自的分布与功能上的分工，而不同物种同一类家族成员具有相似性，但近缘物种相似性最强。 2.为了从生理生化水平上了解盐芥不同组织应答干旱和高盐胁迫的GPXs表达特征，分别测定了干旱和高盐胁迫下盐芥根和叶GPXs酶活性。结果表明，不同胁迫条件下盐芥不同组织部位的GPXs响应胁迫的时间不同。干旱胁迫下，盐芥叶中GPXs在24 h时活性最高，而根中GPXs却在此时活性最低。高盐胁迫下，盐芥叶中GPXs活性在6h处最高，而根中却在12h达到最大。 3.为了从基因表达水平上了解盐芥不同组织应答干旱和高盐胁迫的GPXs表达特征，采用qRT-PCR技术对逆境胁迫下的盐芥TsGPXs各成员进行了基因表达分析。结果表明，在高盐、干旱胁迫下，TsGPX7、TsGPX3、TsGPX5和TsGPX8的表达量变化较大。推测这些成员在盐芥响应高盐、干旱胁迫中发挥重要作用。与拟南芥各成员响应研究结果对比发现，二者GPXs在响应胁迫方面有很大差别。推测尽管两种植物近缘，但在GPXs参与逆境响应中，可能存在不同的调控机制。 4.为了从蛋白表达水平上了解盐芥不同组织应答干旱和高盐胁迫的GPXs表达特征，采用Western Blot技术对胁迫下TsGPXs各成员进行了蛋白表达分析。结果表明，相同逆境胁迫下TsGPXs的蛋白水平表达与基因水平表达分析的结果基本一致，说明盐芥GPXs在响应逆境胁迫方面发挥了作用。但二者存在差异，提示从基因表达到蛋白表达中存在某种调控机制。 5.基于前期研究，选择TsGPX3进行了亚细胞定位和融合蛋白表达研究，建立了相关实验体系。亚细胞定位结果显示，TsGPX3定位在细胞膜上，与预测结果一致。融合蛋白表达结果显示，TsGPX3在37℃条件下诱导5h可获得较高的表达量。 综合对盐芥TsGPXs的生理生化和分子生物学水平的研究结果，可以认为，盐芥GPXs参与干旱和高盐胁迫应答，各成员具有不同的应答模式。研究结果为植物GPXs的结构和应答胁迫的功能研究提供了重要的实验依据。

目录

声明

摘要

第1章 前言与综述

1．1 植物中谷胱甘肽过氧化物酶的种类与作用

1．1．1 植物谷胱甘肽过氧化物酶的种类

1．1．2 植物谷胱甘肽过氧化物酶的作用

1．2 基因功能相关研究方法进展

1．2．1 基因的转录水平表达研究

1．2．2 基因的蛋白水平表达研究

1．3 盐芥研究进展

1．3．1 盐芥与拟南芥的对比分析

1．3．2 盐芥的转基因研究

1．3．3 盐芥抗逆机制研究

1．4 问题的提出与实验设计

第2章 TsGPXs与其他植物GPXs比较的生物信息学分析

2．1 实验材料

2．2 实验方法

2．3 结果与分析

2．4 讨论

第3章 TsGPXs响应逆境胁迫的活性分析

3．1 实验材料

3．1．1 植物材料培养和胁迫处理

3．1．2 试剂

3．1．3 仪器

3．2 实验方法

3．3 结果与分析

3．4 小结

第4章 TsGPXs响应逆境胁迫的基因表达研究

4．1 实验材料

4．1．1 植物材料培养和胁迫处理

4．1．2 试剂

4．1．3 仪器

4．2 实验方法

4．2．1 盐芥样品总RNA的提取

4．2．2 反转录cDNA及cDNA质量检测

4．2．3 实时荧光定量PCR

4．3 结果与分析

4．3．1 盐芥样品总RNA的提取

4．3．2 cDNA质量检测

4．3．3 实时荧光定量PCR

4．4 讨论

4．5 小结

第5章 TsGPXs响应逆境胁迫的蛋白表达研究

5．1 实验材料

5．1．1 植物材料培养和胁迫处理

5．1．2 试剂

5．1．3 仪器

5．2 实验方法

5．2．1 盐芥GPXs特异抗体的制备

5．2．2 蛋白质的提取及定量

5．2．3 Western Blot

5．3 结果与分析

5．3．1 盐芥GPXs特异抗体的制备

5．3．2 蛋白上样量的选择

5．3．3 基于Western Blot的盐芥GPXs蛋白表达分析

5．4 讨论

5．5 小结

第6章 TsGPX3响应逆境胁迫的亚细胞定位与融合蛋白表达研究

6．1 实验材料

6．1．1 植物组织的培养

6．1．2 试剂

6．1．3 仪器

6．2 实验方法

6．2．1 TsGPX3的亚细胞定位研究

6．2．2 TsGPX3的融合蛋白表达研究

6．3 结果与分析

6．3．1 TsGPX3的亚细胞定位研究

6．3．2 TSGPX3的融合蛋白表达研究

6．4 讨论

6．4．1 TsGPX3的亚细胞定位研究

6．4．2 TsGPX3的融合蛋白表达研究

6．5 小结

第7章 全文结论与研究展望

参考文献

致谢

缩略词

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