草鱼呼肠孤病毒(GCRV096)VP6和NS38蛋白的免疫原性及其相互作用蛋白的筛选

摘要

草鱼出血病发病率高、流行范围广，且缺乏有效的防治药物，是草鱼养殖发展中的瓶颈问题。草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus，GCRV)是草鱼出血病的主要病原，主要危害草鱼鱼种，严重影响着我国淡水渔业的发展。实践证明，免疫预防是预防该病最为有效的方法之一。但是，GCRV与其它的鱼类呼肠孤病毒之间无交叉抗原，且不同病毒株之间也存在着抗原性差异。有研究表明VP6蛋白诱导中和抗体效价较高，NS38蛋白诱导的中和抗体效价次之。进一步了解VP6和NS38蛋白的免疫原性有助于完善草鱼出血病的免疫预防方法。病毒入侵宿主后，在宿主细胞内大量繁殖，使细胞发生病变，致使宿主发病死亡。深入了解GCRV的侵染机制，找到与病毒蛋白相互作用的宿主蛋白，对病害的防治具有指导作用。本实验以草鱼呼肠孤病毒株096(GCRV096)为研究对象，克隆表达VP6和NS38基因，研究VP6和NS38蛋白的免疫原性；应用酵母双杂交系统筛选与GCRV096 VP6和NS38蛋白相互作用的宿主蛋白。
　　克隆VP6和NS38基因，分别构建原核表达质粒pET28a-VP6及pET28a-NS38，然后导入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达，纯化目的蛋白。用纯化的目的蛋白分别与CIK细胞孵育12h、24h、48h，然后对CIK细胞进行病毒感染13h，荧光定量分析不同时间CIK细胞中VP6及NS38基因的表达量。实验结果表明，VP6和NS38蛋白引发CIK细胞免疫效应的强度随孵育时间的增长而增强，48h时免疫效应最好，VP6蛋白表现的更为明显。用GCRV096感染CIK细胞(蛋白孵育48h)4h、8h、13h，荧光定量分析结果表明，孵育8h时VP6蛋白引发的免疫效应最强，而NS38蛋白是4h。
　　分别将VP6和NS38基因克隆到诱饵载体pGBKT7，构建诱饵质粒pGBKT7-VP6及pGBKT7-NS38，转化酵母菌株Y2HGold，并对诱饵质粒进行自激活作用及毒性检测，结果表明诱饵质粒构建成功。利用SMART技术构建了草鱼肾脏细胞(CIK)的全长cDNA文库，其文库容量为2.4×106，文库滴度为6.44×107cfu/mL。将含有诱饵质粒的Y2HGold菌株与含有文库质粒的Y187菌株相融合，按照MatehmarkerTM GoldYeast Two-Hybrid System操作手册筛选阳性克隆，通过高选择性培养基确定阳性克隆：提取阳性克隆的酵母质粒，再转化大肠杆菌并提纯质粒DNA，将其与诱饵质粒共转化酵母菌株Y2HGold，确定相互作用，并对阳性克隆中插入的cDNA进行测序分析。在VP6相互作用蛋白的筛选中得到4株阳性克隆，经比对分析得到两种与其相互作用的蛋白，其中一种与glyeeraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)高度同源，另一种未找到典型的同源蛋白；而。NS38蛋白得到3株阳性克隆，经比对分析得到两种与其相互作用的蛋白，其中一种与40S核糖体蛋白S16亚基高度同源，另一种未找到典型的同源蛋白。
　　本论文对GCRV096 VP6和NS38蛋白的免疫原性进行了研究，为草鱼出血病的免疫防治研究提供了理论依据；并利用酵母双杂交系统筛选出与VP6和NS38蛋白相互作用的宿主蛋白，为进一步研究VP6与NS38蛋白的生物学功能奠定了基础，对探讨GCRV的侵染机制具有重要意义。