金钱鱼促性腺激素释放激素的克隆及其在生殖调控中的功能研究

摘要

促性腺激素释放激素（GnRH）是由下丘脑分泌的一种肽类激素，与其相应受体结合后可以促进垂体合成和释放促性腺激素（GtH），GtH包括促黄体素(LH)和促卵泡素(FSH)，对动物生殖具有非常重要的作用。在研究克隆了金钱鱼三种GnRH亚型(sbGnRH,cGnRH-Ⅱ andsGnRH)的全长cDNA序列。采用RT-PCR的方法检测了GnRH在各个组织中的表达模式；应用荧光定量PCR技术检测了金钱鱼胚胎发育和性腺发育过程中 GnRH的表达模式，同时检测了离体（0.1，1和10μM）和在体（0.001,0.01和0.1μg/g体重）条件下三种GnRH多肽对垂体FSH和LH mRNA表达的影响，以及雌二醇（E2）对下丘脑GnRH mRNA表达的影响。主要结果如下：主要的结果如下：
　　1.金钱鱼促性腺激素释放激素基因克隆及序列分析。金钱鱼三种GnRH亚型被克隆，其中sbGnRH的全长为334bp，开放阅读框为288bp，编码95个氨基酸；cGnRH-Ⅱ的全长为284bp，开放阅读框为258bp，编码85个氨基酸；sGnRH的全长为288bp，开放阅读框为273bp，编码90个氨基酸。三种GnRH氨基酸序列的同源性比对发现，金钱鱼cGnRH-Ⅱ是最保守的GnRH类型，sGnRH次之，sbGnRH最不保守。进化树分析发现，金钱鱼的三种GnRH的亲缘关系与鲈形目鱼类最近，与哺乳类最远。
　　2.金钱鱼促性腺激素释放激素基因的时空表达模式。在所检测的12种组织（垂体、胃、脑、卵巢、精巢、肾脏、肝脏、肠、脾、鳃、心和肌肉）中，sbGnRH在雌雄金钱鱼的所有组织中都表达，且表达量存在组织差异，而 cGnRH-Ⅱ和 sGnRH仅在雌雄金钱鱼的脑和性腺中表达，暗示 sbGnRH、cGnRH-Ⅱ和sGnRH可能均与生殖调控密切相关，而sbGnRH可能发挥更为广泛的功能；在胚胎发育过程中，三种 GnRH都在原肠胚期间高表达，并在原肠胚晚期达到峰值，而在其他胚胎发育时期则表达量很低，暗示着这三种 GnRH可能都参与调控原肠胚的发生；在个体发育过程中，随着性腺的成熟，sbGnRH的表达逐渐升高，而 cGnRH-Ⅱ和 sGnRH的表达量无显著变化，暗示着在金钱鱼的性腺发育和生殖调控主要由sbGnRH来调控。
　　3.GnRHs对FSH和LH mRNA表达的影响。在体实验显示，金钱鱼腹腔注射不同剂量（0.001,0.01和0.1μg/g体重）的sbGnRH，3h和6h后，三种剂量的sbGnRH均可显著促进FSH mRNA的表达，低、中剂量（0.001,0.01μg/g体重） sbGnRH可促进LH mRNA的表达，但高剂量（0.1μg/g体重） sbGnRH处理对LH mRNA的表达无显著影响；低、中剂量sGnRH对FSH和LH mRNA表达无显著影响，而高剂量sGnRH可显著促进FSH（3,6h）和LH（3h）mRNA的表达，但对6h的LH mRNA表达无影响；与sGnRH作用类似，低、中剂量cGnRH-Ⅱ对FSH和LH mRNA表达无显著影响，处理3h后高剂量cGnRH-Ⅱ可显著促进FSH和LH mRNA的表达，但是处理6h后则没有影响。
　　离体实验显示，以10μM sbGnRH离体孵育金钱鱼垂体，3h和6h后， FSH和LH mRNA的表达显著升高，但是0.1 and1μM sbGnRH则对FSH和LH mRNA的表达没有影响。高浓度(10μM) sGnRH仅能在处理3h后显著促进FSH mRNA的表达，处理6h则不影响FSH mRNA的表达，sGnRH对LH mRNA的表达则始终没有影响。高浓度(10μM) cGnRH-Ⅱ仅能在处理6h后显著促进FSH mRNA的表达，处理3h则不影响FSH mRNA的表达，cGnRH-Ⅱ对LH mRNA的表达则始终没有影响。
　　4.雌二醇对GnRH的反馈调节作用。金钱鱼腹腔注射4μg/g体重 E2，6h后，sbGnRH mRNA的表达显著降低，但cGnRH-Ⅱ和 sGnRH的表达无显著变化；不同剂量的（0.1、1和10μM）E2离体孵育金钱鱼下丘脑3、6和12 h，各剂量雌二醇以明显剂量依存关系显著抑制sbGnRH mRNA的表达，但对cGnRH-Ⅱ andsGnRH mRNA的表达无显著影响。雌激素受体广谱拮抗剂FULVESTRANT能明显促进下丘脑中sbGnRH mRNA的生成。雌激素受体 alpha型拮抗剂 MPP也能在浓度为0.01和0.1μM时显著促进下丘脑中sbGnRH mRNA的产生，而在1μM时对sbGnRH mRNA的表达没有影响，雌激素受体beta型拮抗剂PHTPP能对下丘脑中sbGnRH mRNA的表达没有影响。说明当高浓度的E2可以显著抑制sbGnRH mRNA基因的表达，但是这种抑制作用可以被FULSTRANRT和MPP解除。
　　研究结果表明，金钱鱼中GnRH至少存在三种亚型，即sbGnRH, cGnRH-Ⅱ和sGnRH，但在生殖调控中，sbGnRH发挥主要作用，E2对 sbGnRH的抑制作用主要是通过雌激素受体alpha介导的。

目录

声明

1 前言

1.1 促性腺激素释放激素（GnRH）的命名、结构和种类

1.2 GnRH的分布与起源

1.3 GnRH的功能与表达调控

1.4 金钱鱼简介

1.5 本论文的研究目的及意义

2 金钱鱼GnRH基因的cDNA克隆及序列分析

2.1 材料

2.2 方 法

2.3 结 果

2.4 讨论

3 金钱鱼GnRH基因的表达模式

3.1 材料与方法

3.2 实验结果

3.3 讨论

4 GnRH对金钱鱼垂体中促性腺激素表达的影响

4.1 材料与方法

4.2 实验结果

4.3 讨论

5 雌二醇对金钱鱼GnRH的反馈调节作用

5.1 材料与方法

5.2 实验结果

5.3 讨论

6 结论

参考文献

致谢

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