维持血透的肾衰患者血清HO-1血清及炎症因子改变的相关性研究

摘要

背景：尿毒症患者体内活性氧产生过多和机体抗氧化功能不全所导致的组织氧化应激损伤，是慢性肾衰竭的主要特征，对长期血液透析的终末期肾衰患者血管硬化起到促进作用，反映尿毒症患者体内氧化应激的生物标记物种类繁多，目前认为最有代表意义的氧化应激标记物是MDA，据文献报道未达到血透指征的CRF患者血浆中MDA水平明显高于健康对照组，并且随着肾功能衰退的进程而进行性升高，进行血透的CRF患者MDA水平又明显高于未血透者，而CRF患者血浆中的MDA水平在透析过程中进行性下降，患者血清MDA的升高同CRP以及冠状动脉硬化的进展程度显著相关，以上研究均表明肾衰患者随着病程进展，氧化应激的水平呈上升趋势；与氧化应激相关的动脉粥样硬化是影响尿毒症患者生存质量的主要并发症之一，目前认为慢性炎症状态与动脉粥样硬化同样密切相关，许多论据支持“动脉粥样硬化是一种炎症性疾病”这一论点并且达成共识，其中C反应蛋白(CRP)是慢性炎症状态最敏感的指标，并且CRP水平与尿毒症血液透析患者营养状态有密切的相关性，而高同型半胱氨酸血症是引起血管疾病的一个独立的重要的危险因子，被认为是导致动脉粥样硬化的因素之一；相反，HO-1作为一种最广泛存在的抗氧化防御酶，被证实具有保护血管功能的作用，能够抑制炎症反应的发生和保护血管内皮细胞，使其免于受到氧化应激和炎症等因素的损伤，目前国内有关血红素氧化酶的动物实验研究较多：通过微波照射预处理对诱导兔肝HO-1的实验研究，表明HO-1可能对肝脏缺血再灌注损伤起着重要的作用：通过转染HO-1基因大鼠肝细胞系BRL体外抗凋亡作用的研究证实HO-1表现出较强的抗凋亡能力；通过离体培养的大鼠心脏成纤维细胞低氧预处理研究证实Ho-1mRNA被显著诱导并维持在较高水平；通过研究证实梗阻性黄疸大鼠肺HO-1mRNA高表达有助于减轻梗阻性黄疸所引起的肺损害等等；通过建立容量负荷过重sD大鼠模型并给予氯沙坦治疗研究发现HO-1在调节血压和血管重构方面有重要作用等等：目前临床上关于HO-1在老年人急性心肌梗死(AMI)患者中的表达研究证实老年人AMI时HO-1表达水平明显升高；通过对血红素氧化酶-1、2及内皮素-1在妊娠高血压综合征患者胎盘组织中的表达及作用的研究提示血红素氧化酶的表达减少可能在妊高征的发生、发展过程中起着重要的作用等；而维持血透慢性肾衰患者的HO-1血清表达变化的研究尚有很多空白。 目的：本课题探讨有关维持血透的肾衰患者血清中血红素氧化酶-1(HO-1)与C反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、同型半胱氨酸(Hcy)、脂质过氧化物丙二醛(MDA)等的血清水平同对照人群的差异以及与上述指标在血液透析前后的变化，为临床上应用血红素氧化酶诱导剂防治肾衰患者的血管硬化等并发症提供一定的依据。 方法：实验于2006年5月至6月在解放军305医院中心实验室完成，选择2006-01/2006-03在解放军总医院第二附属医院以及解放军305医院血液净化中心进行常规透析的慢性肾衰竭患者，纳入标准：1．患者血清肌酐等指标符合终末期肾衰竭的诊断标准；2．患者透析时间在3个月以上，愿意接受此项实验并签署知情同意书；3．无严重合并症存在间共收入符合条件患者26例，男17例，女9例，年龄27～55岁，原发病病因为：慢性肾小球肾炎12例，慢性间质性肾炎5例，成人型多囊肾3例，高血压病2例，糖尿病肾病l例，原因不明3例；以上病例按透析年限(3年以内和3年以上)分为长期组和短期组，每组各13例，其中长期组男性7例，女性6例，短期组男性10例，女性3例，两组患者性别年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。透析方式：所有患者均给予碳酸氢盐透析，透析液钙1.5mmol/L，每周2～3次，每次4h，血管通路自体动静脉内瘘，透析器采用聚砜膜(F6)，均不复用，上述患者在一周内分别于血液透析前后静脉取血，离心分出血清后于-20℃冻存；对照组：选取年龄及性别匹配的解放军三零五医院体检人员24例组成，均为无心肺疾患，肝肾功能正常的人员，其中男12例，女12例，年龄24～49岁，静脉取血、离心后血清于-20℃冻存；患者组与对照组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。取血前后采集所有人员相关的临床数据，并定量检测患者组血透前后和对照组的实验室指标：(1)应用Canada Stressgen Bioreagents Corporation的HLimam Ho-1ELISA Kit通过ELISA方法定量测定血清Ho-1水平：具体步骤包括配制标准品、洗涤Buffer、稀释Ho-1抗体、配制抗兔IgG HRP结合物稀释液，准备工作完成后使用Organon Teknika microwell system全自动酶免疫分析仪进行测定(加样品和标准品、使用洗涤缓冲液反复洗涤6次、加抗人HO-1抗体孵育后再次洗涤、加入抗兔IgG HRP结合物后洗板、然后加入TMB底物显色液和终止液终止反应)，450nm波长下测出各管的吸光度和绘制标准曲线，计算出各管测定结果；(2)采用France Diaclone Bioreagents Corporation的High sensitivityhuman IL-6 ELISA KIT测定血清IL-6水平，具体步骤如下：用标准品稀释液将标准品稀释到50pg/ml为主液，然后再用该主液稀释到各标准管、标准稀释液进行稀释配制Control液，稀释生物素化IL-6抗体、用蒸馏水进行200倍稀释洗涤缓冲液，稀释抗生蛋白链霉素-HRP，使用Organon Teknika microwellsystem全自动免疫分析仪，进行免疫分析测定(根据标本、标准、空白及质控数量决定使用板条孔数、程序设定、添加生物素化的IL-6抗体并振荡、保温3小时、缓冲液洗板6次、将各管分别加入制备的抗生物蛋白的链霉素化的HRP并振荡、在室温下保温30分钟、缓冲液洗板6次、每孔加入制备的基质液TMB并保温25分钟、加入终止液H<,2>SO<,4>到各孔中、终止反应)，绘制标准曲线，读出实验结果；(3)使用BECKMAN IMMAGE免疫化学自动分析系统及专用试剂盒测定血清CRP水平，大致步骤如下：按IMMAGE分析仪的要求，将样品、质控品和试剂分别置于固定的位置，按顺序和体积由仪器自动加入相应的试剂(样品、标准品、质控品、CRP抗体、缓冲液、稀释液)，仪器自动检测出抗原抗体蛋白复合物浊度并计算出结果；(4)使用AxSYM Homocysteine assay机器及配套试剂，采用荧光偏振法(FPIA)测定血清Hcy水平，步骤如下：试剂准备(含荧光标记SAH的示踪剂、含SAH-hydrolase磷酸盐缓冲液、鼠抗SAH单克隆抗体、含DTT和adensine的预处理液、稀释液、AxSYM HCY校正液、AxSYM HCY质控液)，使用AxSYM System全自动免疫分析仪进行分析(定标、质控、样品申请、放置样品、试剂装载、检查样品的类型和完整度，检查上机库存和废物量，检查测试所需的样品量和消耗品量是否足够，检查上机试帮、标准品、质控品、纤维杯和大瓶缓冲液的效期，所有检查结束后开始启动测定并自动读数)；(5)MDA的血清水平测定，步骤入下：试剂配制(无水乙醇、冰醋酸、试剂一：试剂盒自带，20ml/瓶，观察无凝块、无悬浮物；试剂二：12ml/瓶，取一500ml试剂瓶，装340ml蒸馏水彻底溶解；试剂三：粉剂一只，先用500ml三角烧瓶将60ml蒸馏水煮沸，将粉剂倒入其中，然后再继续加热直至完全溶解，再加60ml冰醋酸；标准品：四乙氧醛丙烷10nmol/ml，5ml/1瓶)，使用BECKMAN Du530DNA/protein Analyzer比色计进行测定，测试步骤(所有试剂均使用microlab500 series加样器加样、摇动试管架使试管内试剂混匀、用锡纸薄膜将全部试管覆盖好，在每个试管上方扎几个小孔，以便蒸汽流通，置入95℃恒温水浴箱中保温40分钟、取下薄膜后离心3500转/分钟共15分钟、用BECKMANDu530 DNA/protein Analyzer比色计进行比色，λ=532nm，蒸馏水调“0”，以“0”和10nmol/ml两点做标准曲线)。 结果：(I)维持血透的肾衰患者透析前血清HO-1、IL-6、CRP、Hcy水平较对照人群明显升高，与对照组相比差别显著(P<0.01)；(2)患者组血液透析治疗前后上述部分指标血清水平有明显改变，IL-6、Hcy血清水平明显下降(P<0.05)：(3)长期组患者血透前后上述指标均无显著性差异(P>0.05)：(4)短期组患者血透后Hcy水平低于血透前(P<0.01)，其它指标血透前后均无显著性差异(P>0.05)；(5)长期与短期血透组透析前上述指标的血清水平均无显著性差异。 结论：维持血透的肾衰患者血清HO-1与CRP、IL-6、Hcy等指标的血清水平较对照人群均明显升高，提示肾衰患者体内炎症水平、血管硬化损伤等血清水平升高的同时，作为保护性指标的HO-1血清水平也随之上升，应用血红素氧化酶诱导剂可能对肾衰患者的血管硬化进程及炎症水平起到一定的抑制作用；而血液透析对IL-6、Hcy也具有一定的清除作用。

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1材料、仪器和方法

2结果

3讨论

4结论

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