幽门螺杆菌napA基因的克隆、表达及NAP蛋白抗原表位研究

摘要

一、研究背景和目的 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)是一种微需氧革兰阴性螺旋杆菌，可导致胃炎和消化道溃疡，并与胃腺癌、胃黏膜相关性淋巴样组织(gastricmucosal-associated lymphoid tissue lymplloma，MAIT)淋巴瘤病的发生密切相关，全球人口感染率超过50％，1994年被国际癌症研究中心定为Ⅰ类致癌物。 目前，临床上多采用质子泵抑制剂和抗生素联合治疗，但存在耐药性、病人依从性差、易复发等副问题，效果不甚理想。因此，疫苗是防治Hp感染的有效手段，筛选免疫保护力强的无毒抗原是研制疫苗的关键。研究较多的抗原主要有尿素酶B(Urease B)、空泡毒素(Vacuolatint cytotoxin A，VacA)、细胞毒素相关蛋白(Cytotoxin associated protein A，CagA)等，在动物实验中虽显示一定的免疫保护作用，但都具有一定的局限性，迄今未有理想的疫苗问世。 中性粒细胞激活蛋白(Neutrophil-activating protein，NAP)是近期发现的与黏附和炎症相关的重要毒力因子，由napA基因编码，分子量为15kDa，4股螺旋结构的单体构成十二聚体铁蛋白，NAP与细菌DNA保护性蛋白(Dps)及铁蛋白(Flp)具有高度同源性，存在于所有菌株中。NAP能持续趋化和激活嗜中性粒细胞，促进中性粒细胞对胃上皮细胞的黏附，刺激胃黏膜上皮细胞快速反应，通过上调VCAM-1、ICAM-1、E选择素和前炎症细胞因子及趋化因子促进白细胞的募集，并促使中性粒细胞释放反应性氧代谢物，引发胃黏膜炎症病变。多数Hp感染者血清中存在抗NAP抗体，动物实验证实NAP免疫小鼠可抵抗Hp的感染，保护率达80％。可见，NAP是Hp重要的毒力因子及候选抗原。本研究在克隆表达NAP的基础上，展开NAP的表位组学研究，利用噬菌体肽库展示技术，寻找NAP精确的抗原表位，为筛选更多的保护性抗原表位及制备多价合成肽亚单位疫苗奠定基础；展开胃癌、消化道溃疡、胃炎病人与正常人群抗NAP抗体水平的调查，探讨NAP与胃癌之间的相关性，并对获得的3株抗NAP单克隆抗体(monoclonal antibodies，mAb)进行鉴定，探讨其临床应用价值。 二、研究方法 1、根据GenBank提供的Hp 26695株基因组序列设计引物，以NCTC 11639基因组为模板，扩增napA基因，连接pMD18-T载体，构建napA/pMD18-T重组克隆，PCR及双酶切鉴定后测序，将重组质粒napA/pMDl8-T与表达载体pGEX-4T-1用EcoR Ⅰ和XholⅠ双酶切后连接，转化宿主菌Top10，构建融合表达载体napA/pGEX-4T-1，双酶切后测序。对测序结果进行生物信息学分析：利用BLAST工具进行同源性搜索；利用DNAMAN软件分析napA的DNA序列和编码蛋白的特性；利用harvard大学的在线软件进行抗原表位预测；应用Signal P3.0 server分析氨基酸序列中是否存在信号肽。 2、利用IPTG诱导表达目的蛋白，优化表达条件，实现融合蛋白的可溶性表达，通过GST亲和层析柱纯化NAP蛋白，SDS-PAGE电泳及Western Blot鉴定表达蛋白。 3、利用间接ELISA法，以纯化蛋白NAP与Hp阳性胃癌、消化道溃疡、胃炎患者血清及正常人群血清进行反应，检测NAP的免疫反应性，比较NAP在胃病人群及正常人群的抗体水平，探讨NAP与胃癌的相关性。4、以天然的Hp全菌蛋白为抗原免疫BALB/C小鼠，利用杂交瘤技术制备mAb。利用间接ELASA法，鉴定mAb与肠道致病菌交叉免疫反应，以NAP蛋白为抗原，从不与肠道致病菌发生交叉免疫反应的mAb中筛选抗NAP mAb。利用鼠mAb亚类检测试剂盒，检测阳性杂交瘤细胞培养上清，鉴定抗NAP mAb的亚类；采用间接ELISA法测定抗NAP mAb抗体效价；选用间接ELISA方法，测定抗NAP mAb浓度，按公式Kaff=(n-1)/2(n[Ab′]t-[Ab]t)计算亲和常数。将抗NAP mAb与10株常见肠道致病菌进行免疫组化试验，鉴定抗体反应的特异性；将NAP mAb与Hp涂片样本及Hp感染患者胃黏膜标本进行免疫组化试验，鉴定mAb反应的敏感性。 5、利用噬菌体随机7肽库，以抗NAP mAb(E019)为固化抗原，通过EIASA法筛选阳性噬菌体克隆，竞争结合抑制试验鉴定NAP的抗原表位。 三、研究结果 1、成功扩增及克隆NCTC11639株napA基因，基因全长435bp。结果已登录GenBank，登录号为DQ341279。 2、BIAST同源检索显示该基因与GenBank中公布的其它20株菌株的napA基因的核酸序列相比有高度同源性(94％～98％)；napA基因编码蛋白与细菌DNA保护性蛋白(Dps)及铁蛋白具有高度同源性，与人及哺乳动物基因组DNA同源性很低(<10％)。 3、经二级结构、亲水性、抗原性指数、信号肽、三维结构分析显示有4个高抗原性肽段，分别是第4～24，55～77，95～103，118～140氨基酸序列，平均抗原指数为1.0236，其中118～140长22个氨基酸残基的肽段抗原性指数1.15，亲水性强、含有1个B转角，表明该肽段可能含有良好的抗原表位。 4、PCR证实napA在Hp菌株中普遍存在，与国内外文献报道相同，说明该基因高度保守。 5、构建napA-pGEX-4T-1-E.coli Top 10高效可溶性原核表达系统，通过优化表达条件，确定最佳表达条件为1mmol/L IPTG诱导浓度，诱导温度30℃，诱导时间4 h。 6、表达产物经GST亲和层析纯化，获得纯度较高且有生物活性的目的蛋白，分子量是44Kda。重组NAP与患者血清及购买的商品化兔抗全菌Hp抗体之间可发生特异性免疫反应，不与正常人血清反应，说明重组NAP具有良好的免疫反应性。 7、Hp IgG抗体试剂盒检测结果表明：64％正常人群Hp感染阳性，均值为0.46±0.27；70％胃癌患者Hp感染阳性，均值为0.55±0.13；68％胃溃疡患者Hp感染阳性均值为0.43±0.21；64％胃炎患者Hp感染阳性，均值为0.68±0.13。 8、NAP抗体水平检测结果表明：97.5％胃癌患者血清中NAP抗体检测结果阳性，均值为1.01±0.13；92.9％胃溃疡患者血清中NAP抗体检测结果阳性，均值为0.98±0.17；85.7％胃炎患者血清中NAP抗体检测结果阳性，均值为0.89±0.07；正常人群血清中60％NAP抗体检测结果阳性，均值为0.61±0.14。20～29岁与40～49岁年龄段抗体水平有明显差异(*P<0.05)，其它年龄段NAP抗体水平无明显差异。 9、从29株小鼠抗Hp全菌mAb中筛选获得3株抗NAP的mAb，mAb经亚类鉴定显示全部为IgGl，抗体效价为1:16至1:32，抗体亲和力为1×10<'10>至5.2×10<'12> mol/L。Western blot鉴定表明，NAP蛋白可与NAP mAb之间发生免疫学反应。免疫组化结果表明，3株mAb特异性较高，敏感性强，能与Hp纯培养物及Hp感染胃黏膜标本发生强阳性反应，不与其他肠道菌发生反应。 10、利用噬菌体肽库技术，初步筛选到NAP的线性表位(FAHLATQ)。 四、结论 1、本研究首次从国际标准株NCTC 11639基因组DNA中克隆中性粒细胞激活蛋白基因napA，Genbank登录号DQ341279。 2、成功构建napA-pGEX-4T-1-E.coli Top 10高效可溶性原核表达系统。重组NAP经鉴定具有良好的免疫原性和免疫反应性，可作为Hp基因工程亚单位疫苗的候选组分，并为研究Hp致病机制、免疫保护机制及诊断试剂奠定基础。3、NAP是高度保守的基因，是良好的免疫原。初步预测NAP有4个高抗原性肽段，其中118～140肽段可能含有良好的抗原表位。 4、成功制备高亲和力抗NAP全菌mAb，3株mAb(E006、E019、E023)特异性高，敏感性强，具有良好的应用前景。 5、Hp在广东地区的胃病及正常人群中感染率较高；NAP抗体表达水平高显示NAP与胃癌有一定关联，NAP是胃癌发生高风险因子；患者年龄与NAP抗体水平无明显相关性，此项研究为NAP病原学研究提供了理论基础，为Hp感染相关胃癌的诊断、治疗和疫苗研究打下基石。 6、首次筛选到NAP的线性表位(FAHLATQ)，位于预测肽段(118～140)内，为下一步开展多价合成肽疫苗及蛋白质组学研究奠定良好基础。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩写词表

声明

前言

第一部分幽门螺杆菌napA基因的序列测定及生物信息学分析

第二部分幽门螺杆菌NAP克隆与表达

第三部分幽门螺杆菌NAP抗体水平与胃癌相关性研究

第四部分幽门螺杆菌NAP单克隆抗体的制备及鉴定

第五部分应用噬菌体随机肽库技术筛选幽门螺杆菌NAP的抗原表位

全文总结

参考文献

攻读学位期间发表论文

致谢