小麦叶片中潜伏侵染白粉菌的Nested PCR检测

摘要

小麦白粉病是小麦生产上的主要病害之一,病害流行的预测预报和风险估计是综合防治的重要部分.尽早、准确地估计病害发生趋势是有效的预测预报的关键.虽然我国小麦白粉病发生规律因地区和气候条件而异,但对越冬麦苗和越夏自生麦苗的潜育侵染程度做及时、准确的监测成为不同地区病害预测预报和风险估计中普遍存在的关键环节.而这方面的进展受到传统、落后方法的制约,如叶片或幼苗取样培养的方法耽工、费时、灵敏性差.快速发展的分子生物学技术显示了有效改进流行学方法的巨大潜力.本研究应用分子生物学原理、技术和方法探讨准确、快速地测定小麦白粉病潜育侵染的新方法,为改进流行学的传统监测方法奠定了基础. 本研究根据小麦白粉菌 (Blumeria graminis f.sp.tritici) 核糖体内转录间隔区 (ITS) 序列设计合成常规PCR 引物F1/R1、F2/R1、F3/R1.应用小麦其它病原真菌做参照,表明所设计的三对引物均对小麦白粉菌有特异性,能区分小麦白粉菌和其它麦类病害.其中F1/R1较F2/R1、F3/R1灵敏性更高,可检测到1pg白粉菌DNA.在筛选获得的特异性引物F1/R1所扩增产物的序列基础上,设计合成了Nested-PCR 内外引物,并对其进行灵敏性测定.应用所设计的Nested-PCR流程,从纯培养的病原菌中可检测到的最低病菌DNA含量为0.1fg. 本研究建立了从小麦病叶中提取白粉菌DNA的技术.应用常规PCR和Nested PCR对室内用不同接种量人工接种白粉菌后在不同潜育侵染阶段取样的小麦叶片做病原菌的PCR测定分析.用最低接种量300个孢子/cm<'2>时,采用常规PCR能从接种3d后的小麦叶片中检测到白粉菌DNA,而用Nested-PCR能从接种1d后的小麦叶片中检测到潜伏侵染的白粉菌.在人工接种的条件下Nested PCR比常规PCR对检测相同程度的潜伏侵染至少提前2-3d.在潜育侵染早期和接种浓度低时,Nested PCR 比常规 PCR 在检测效果上有明显优势. 从北京和山东两地的秋苗上,共选取11个采样点对人工接种小麦白粉菌或自然侵染的叶片取样,用常规 PCR 和 Nested-PCR 对未显症叶片的检测结果表明,常规PCR测定的叶片侵染率对叶片离体培养测得的侵染率的直线回归预测式只在0.05水平上显著(r<'2>=0.49,P=0.0163),有6个样点未测到侵染病叶.而Nested PCR测定的叶片侵染率与叶片离体培养测得的侵染率的直线回归式极显著(r<'2>=0.66,P=0.0023).此结果表明,Nested PCR方法的预测性比常规PCR方法要好,但其预测结果比实际叶片侵染率偏高,显示Nested PCR的高灵敏特性.本研究对小麦白粉病的早期、快速和准确的监测及预测预报有实际应用价值.

目录

文摘

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第一章 引言

1.1小麦白粉病概述

1.1.1小麦白粉病发生、分布和危害

1.1.2病害症状

1.1.3病原菌形态及生物学特性

1.1.4病害侵染循环和生活史

1.2植物病害和病原菌的监测

1.2.1植物病害的监测

1.2.2植物病原菌的监测

1.3几种常用分子标记技术

1.4分子技术在植物病原菌检测方面的应用

1.5病原菌分子检测的灵敏性与病害的早期监测

1.6本研究内容、目的及意义

第二章 常规PCR引物的设计及其特异性与灵敏性分析

2.1材料与方法

2.1.1供试植物材料来源和准备

2.1.2供试菌株来源、收集与保存

2.1.3供试材料的DNA提取

2.1.4病原菌的常规PCR

2.1.5常规PCR引物的特异性检测

2.1.6常规PCR引物灵敏性测定

2.2结果与分析

2.2.1病原菌DNA检测

2.2.2常规PCR 物特异性的检测

2.2.3常规PCR引物灵敏性测定

2.3小结

第三章 Nested PCR

3.1材料与方法

3.1.1 Nested-PCR引物设计

3.1.2Nested-PCR内引物的特异性分析

3.1.3 Nested-PCR内引物的灵敏性测定

3.1.4 Nested PCR流程

3.1.5 Nested PCR的灵敏性分析

3.2结果与分析

3.2.1 Nested-PCR内引物特异性分析

3.2.2 Nested-PCR内引物灵敏性测定

3.2.3 Nested-PCR的灵敏性测定

3.2.4 Nested PCR和常规PCR灵敏性的比较

3.3小结

第四章 人工接种叶片的潜育侵染测定

4.1材料与方法

4.1.1供试植物材料和白粉菌菌株

4.1.2供试材料的准备

4.1.3人工接种

4.1.4取样

4.1.5小麦叶片基因组DNA的提取

4.1.6人工接种的小麦叶片中的白粉菌PCR检测

4.1.7数据分析

4.2结果与分析

4.2.1常规PCR检测小麦叶片中显症白粉菌

4.2.2不同侵染量未显症小麦叶片中白粉菌的Nested-PCR检测

4.3小结

第五章 田间小麦叶片潜育侵染的测定

5.1材料与方法

5.1.1试验材料的获得

5.1.2常规PCR和Nested PCR检测

5.1.3数据分析

5.2结果与分析

5.2.1中国农科院植保所农场试验田小麦叶片常规PCR和Nested PCR田间检测

5.2.2山东烟台大庄头村小麦叶片常规PCR和Nested PCR田间检测

5.2.3用常规PCR和Nested PCR方法估计田间侵染叶片的潜育侵染率

5.3小结

第六章 结论与讨论

6.1结论

6.2讨论

6.2.1改进的CTAB法提取小麦白粉菌、小麦锈菌DNA的优势

6.2.2关于利用rDNA ITS设计引物

6.2.3 PCR抑制物与Nested-PCR的污染问题

6.2.4隐症时期Nested-PCR检测与最终发病率关系

6.2.5关于Nested-PCR的改进

6.2.6本研究的创新点和在流行学和病害防治方面的应用价值

参考文献

附录

致谢

作者简历