偃麦草属牧草苗期耐盐性综合评价及中间偃麦草Na/H逆向转运蛋白基因的克隆

摘要

盐胁迫是全世界范围内影响作物产量的最严重的非生物胁迫之一.利用基因工程提高植物的耐盐性,培育出能适合在盐渍化土地上生长的植物品种是有效利用盐渍化土地的主要方法.指标筛选与综合评价是牧草耐盐性育种的前提.偃麦草属(Elyrtigia Desv.)植物是优质的栽培牧草,也是小麦的野生近缘种,在小麦的遗传改良中具有十分重要的利用价值. 本实验对引自国外的21份野生偃麦草属种质资源材料,在不同盐分梯度胁迫下,研究了苗期生长、渗透调节、叶片Na<'+>和K<'+>含量、细胞膜伤害、叶片光合指标与植物耐盐性的关系;进行了苗期耐盐性指标筛选与综合评价,克隆了中间偃麦草液泡膜.Na<'+>/H<'+>逆转运蛋白基因,并进行了生物信息学分析.研究结果如下: (1) 不同NaCI浓度胁迫下偃麦草属牧草存活率随着浓度增高而降低,对照、盐浓度0.4﹪、0.5﹪NaCl胁迫下存活率都达到了100﹪,盐浓度0.6﹪胁迫下存活率在63﹪～100﹪,其中存活率都大于50﹪;盐浓度0.8﹪胁迫下存活率在27﹪～93﹪,其中存活率大于50﹪的有15份;盐浓度1.0﹪胁迫下存活率在100﹪～73﹪,其中存活率大于50﹪的只有5份,供试材料出现大量死亡.综合评价值D和存活率耐盐系数高度正相关,相关系数为0.9370,表明综合评价值D能较好地反映材料耐盐性的真实情况,在盐胁迫下偃麦草属牧草材料存活率越高其耐盐性就越强,反之存活率越低其耐盐性越差. (2) 通过21份偃麦草属材料存活率、株高、根茎比、生长胁迫指数和叶片伤害率的测定,利用主成分分析法和隶属函数法,对21份偃麦草属材料耐盐性进行了综合评价,结果表明:材料 ZXY03P-388,ZXY03P.-349, ZXY03P-433 的耐盐性较强, 材料ZXY03P-271,ZXY03P-289,ZXY04P-157耐盐性较差,其余材料耐盐性居于中间. (3) 选取10份材料,在不同梯度NaCl胁迫下,通过存活率、K<'+>/Na<'+>、丙二醛含量、脯氨酸含量等12项与植物耐盐性相关指标的测定,利用相关分析、主成分分析、隶属函数法和通径分析,进行了偃麦草属植物苗期耐盐性指标筛选及综合评价的研究.结果表明:存活率、K<'+>/Na<'+>、丙二醛含量、脯氨酸含量、生长胁迫指数、相对生长速度6个指标可以对偃麦草属植物耐盐性进行综合评价;10个材料的耐盐性预测值(VP)与耐盐综合评价值(D)极显著相关. (4) 盐胁迫下,偃麦草属材料叶片游离脯氨酸、可溶性糖含量逐渐积累,增强了其渗透调节能力;低浓度胁迫下,叶片拒Na<'+>能力较弱,'Na<'+>含量急剧增加,K<'+>含量下降迅速,叶片害率与丙二醛含量逐渐增加,随着盐浓度增大,离子泵被活化,叶片拒Na<'+>能力增强,Na<'+>含量增加与K<'+>下降较为缓慢,细胞膜伤害较为严重,伤害率迅速增加,幼苗生长衰弱,自身保护能力下降,丙二醛含量随之下降;盐胁迫下叶绿素含量、叶片蒸腾速率逐渐下降,叶片净光合速率下降主要是由于叶肉光合细胞活性受到抑制而引起的;随着盐浓度的升高,植株生长受到抑制,所有材料的株高、分蘖数、总生物量、存活率显著降低. (5) 根据小麦液泡膜Na<'+>/H<'+>逆转运蛋白基因TaNHXl的全长序列设计引物,通过RT-PCR直接扩增的方法从中间偃麦草(Elytrigia intermedia)中克隆到了TaNHXl的同源基因,命名为TiNHXl(AcessionNumeberl.:EF409418).TiNHXl最大开放阅读框为164lbp,编码含有546个氨基酸残基、分子量为 59.8 kDa的蛋白,预测等电点8.0.TiNHX1含有38个碱性氨基酸,36个酸性氨基酸,256个疏水氨基酸及129个极性氨基酸.二级结构预测表明该蛋白含约44﹪的α-螺旋、21﹪的β-折叠、4﹪的β-转角和29﹪的不规则卷曲.亲疏水性分析显示,TiNHX1含有12个连续的疏水片断,其中10个可能构成穿膜螺旋.序列分析显示,TiNHX1与小麦(Triticum aestivum)、长穗偃麦草(Elytrigia elongate)、水稻(Oryza sativa)、小盐芥(Thellungiella halophila)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等植物的液泡膜Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白高度同源,序列相似性分别为97﹪、96﹪、85﹪、68﹪、67﹪.序列比对结果以及进化树分析均表明 TiNHX1 应为定位于中间偃麦草液胞膜上的Na<'+>/H<'+>逆向转运蛋白.

目录

文摘

英文文摘

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第一章前言

1.1盐分胁迫对植物的伤害

1.2植物的耐盐机制

1.3牧草耐盐鉴定指标研究进展

1.4植物抗逆性综合评价方法研究进展

1.5 Na+/H+逆向转运蛋白及其与植物耐盐性的关系

1.6偃麦草属牧草相关研究

第二章21份偃麦草属牧草苗期耐盐性综合评价

2.1材料与方法

2.1.1试验材料

2.1.2实验处理与方法

2.1.3数据处理

2.2结果与分析

2.2.1盐胁迫下偃麦草属牧草存活率的变化

2.2.2单项指标的耐盐系数

2.2.3 21份种质材料苗期耐盐性综合评价

2.3 讨论

2.4小结

第三章偃麦草属植物苗期耐盐性指标筛选及综合评价

3.1材料与方法

3.1.1试验材料

3.1.2试验材料处理

3.1.3试验指标测定

3.1.4数据处理

3.2结果与分析

3.2.1单项指标的耐盐系数及简单相关分析

3.2.2应用主成分分析筛选综合评价指标

3.2.3偃麦草属牧草苗期耐盐性综合评价

3.2.4综合评价值与各指标的回归分析

3.2.5 12个指标对耐盐性综合评价值(D)的通径分析

3.3讨论

3.3.1偃麦草属牧草苗期耐盐性评价指标的选用

3.3.2偃麦草属牧草苗期耐盐性综合评价

3.3.3偃麦草属牧草耐盐性综合评价值D与存活率的关系

3.4小结

第四章盐胁迫下中间偃麦草的生理响应及生长研究

4.1材料与方法

4.1.1实验材料

4.1.2试验材料的处理

4.1.3实验指标的测定

4.2试验结果与分析

4.2.1中间偃麦草渗透调节与耐盐性关系

4.2.2偃麦草K+、Na+含量与耐盐性关系

4.2.3中间偃麦草细胞膜伤害与耐盐性关系

4.2.4偃麦草耐盐性与叶片光合相关指标的关系

4.2.5偃麦草耐盐性与苗期生长的关系

4.3讨论

4.3.1盐胁迫下植物叶片游离脯氨酸积累

4.3.2盐胁迫下植物叶片膜质过氧化产物丙二醛的积累

4.3.3盐胁迫下植物叶片净光合速率和蒸腾速率的变化

4.3.4盐胁迫下叶片Na+、K+、K+/Na+变化

4.4小结

第五章中间偃麦草Na+/H+逆向转运蛋白的分子克隆及其生物信息学分析

5.1试验材料与方法

5.1.1试验材料

5.1.2试验方法

5.1.3氨基酸与蛋白质生物信息学分析

5.2结果与分析

5.2.1总RNA的提取

5.2.2中间偃麦草液泡膜Na+/H+逆向转运蛋白基因的克隆

5.2.3 TiNHX1基因序列特征分析

5.2.4同源比对与系统树构建

5.3讨论

5.4小结

第六章全文结论

参考文献

致 谢

作者简历