根部特异性启动子rRB7在拟南芥和棉花中的表达研究

摘要

启动子在基因表达调控中起关键性作用,它在很大程度上决定目的基因表达的时间、空间和强度.当前商业化应用的植物基因工程产品大多使用的是组成型启动子,它们驱动外源基因在植物各种组织和所有发育阶段表达,这无疑增加了植物的代谢负担,并造成物质和能量的浪费,往往还会引起植物形态发生改变,甚至影响植物生长发育.因此,本研究从烟草基因组中克隆根部特异性表达TobRB7基因启动子rRB7,并分别与gfp和vgb基因融合,转化拟南芥和棉花,取得如下结果: 1.构建成功3个植物表达载体:pGB1121GFP,携带35s启动子驱动gfp基因的表达盒;pGBIrRB7GFP,携带rRB7启动子驱动gfp基因的表达盒;pGBIrRB7VHB,携带rRB7启动子驱动vgb基因的表达盒. 2.通过花沾法将植物表达载体pGBI121GFP、pGBIrRB7GFP导入拟南芥,分别获得T1代再生植株15株和16株.利用激光共聚焦显微镜扫描转基因拟南芥幼苗不同部位的荧光强度,结果表明,rRB7启动子驱动GFP基因在根尖伸长区、成熟区以及根颈部优势表达,但其荧光强度比对照CaMV35S启动子低约23.6﹪,在茎、叶中基本不表达,说明该启动子具有根组织特异性,但与CaMV35S启动子相比不是一个强启动子. 3.通过花粉管通道法将植物表达载体pGBIrRB7VHB导入陆地棉品种Y18中,经卡那霉素筛选和PCR鉴定,得到转基因植株15株.用荧光定量PCR技术检测rRB7启动子驱动vgb基因在部分单株根组织中的相对表达量,结果表明启动子片段rRB7可驱动vgb基因在棉花根组织特异表达,但单株表达水平均低于对照CaMV 35S启动子,与拟南芥中的检测结果一致.叶绿素含量测定结果表明,在根部特异性表达vgb基因对转基因棉花叶绿素含量变化的影响较小. 本论文分析了来源于烟草的rRB7启动子在拟南芥及棉花中表达的组织特异性,验证了该启动子在植物根组织中具有优势表达特性,并与vgb基因融合,提高了转基因棉花的耐涝性,为rRB7启动子应用于植物根组织的基因工程改良研究打下了基础,并对增强植株吸收水分,肥料及微量元素、有效抵抗土传病虫害以及在特殊生态环境下生存均具有一定的实际意义.

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略表

独创性声明及关于论文使用授权的声明

第一章绪论

1.1根对于高等植物具有重要的生理意义

1.1.1根的主要生理功能

1.1.2改良高等植物根的性状具有重要意义

1.2启动子研究进展

1.2.1概述

1.2.2启动子的一般结构

1.2.3植物启动子的分类和应用

1.2.4启动子的选择和改造

1.3 TOBRB7基因及其启动子研究进展

1.4植物遗传转化方法

1.4.1农杆菌介导法

1.4.2基因枪法

1.4.3花粉管通道法

1.4.4植物遗传转化存在的问题与对策

1.5转基因植物的检测技术

1.5.1转基因整合状况的检测

1.5.2外源基因表达特征的检测

1.6绿色荧光蛋白

1.6.1绿色荧光蛋白的结构与特点

1.6.2绿色荧光蛋白的种类

1.6.3绿色荧光蛋白作为标记分子的优点

1.6.4绿色荧光蛋白的应用

1.7本研究的目的意义

1.8本研究的研究方案

第二章植物表达载体的构建

2.1材料与方法

2.1.1试验材料

2.1.2方法

2.2结果与分析

2.2.1烟草TobRB7启动子根部特异性顺式元件的获得

2.2.2基础质粒的酶切图谱及鉴定

2.2.3质粒载体的构建及其鉴定

2.3小结

第三章拟南芥转化及GFP基因表达分析

3.1材料与方法

3.1.1材料

3.1.2方法

3.2结果与分析

3.2.1拟南芥转化

3.2.2阳性转基因植株的PCR鉴定

3.2.3转基因拟南芥中GFP表达分析

3.3小结

第四章利用RRB7启动子驱动VGB基因在棉花中的表达分析

4.1材料与方法

4.1.1材料

4.1.2方法

4.2结果与分析

4.2.1花粉管通道法转化棉花

4.2.2转基因后代筛选

4.2.3 Kana抗性植株的PCR检测

4.2.4 vgb基因表达量的荧光定量PCR分析

4.2.5淹涝对转vgb基因棉花相关性状的影响

4.3小结

第五章结论、创新点及讨论

5.1结论

5.2创新点

5.3讨论

5.1.1植物基因工程研究中启动子的选用和改造

5.1.2荧光定量PCR技术检测基因的表达量

参考文献

致谢

作者简历